猪轮状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用

作     者：吴奇英 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何启盖;徐高原

授予年度：2013年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：轮状病毒 VP6 实时荧光定量RT-PCR HE染色 免疫组化 粪便排毒规律 

摘      要：猪轮状病毒感染(Porcine rotavirus, PoRV)是一种严重的接触性肠道传染病,导致仔猪出现呕吐、腹泻、脱水和消瘦等临床症状,也能够致使仔猪死亡,特别是对7日龄左右的仔猪造成的危害最为严重。该病主要暴发于寒冷时期的冬季以及早春时节,且传播迅速,给养猪产业带来巨大的损失。现阶段实验室对PoRV病原的检测主要是利用常规RT-PCR方法,但是常规RT-PCR方法相对于荧光定量RT-PCR灵敏度较低。常规RT-PCR只能检测到发病严重时期的猪只,对轮状病毒感染早期的猪只,则需要灵敏度更高的检测方法来实现,以达到在猪感染的潜伏期就可以诊断并采取有效的防控措施来减少PoRV的暴发带来的损失。 本试验主要是为临床检测PoRV建立灵敏性更高的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。根据GenBank中登录的A群猪轮状病毒(PoRV)TM-a毒株序列,我们针对结构蛋白VP6基因设计了一对常规RT-PCR特异性引物和一对荧光定量RT-PCR特异性引物和探针,将通过常规RT-PCR扩增VP6获得的目的片段与pMD-18T载体连接构建标准阳性质粒,建立了检测A群PoRV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评价。通过荧光定量RT-PCR反应获得的标准曲线可知,反应中模板DNA的量与荧光定量RT-PCR的CT值呈一定的线性关系,且得其直线方程是y=-3.979gx+43.152,相关系数达到0.997。此方法可以检测出最低的PoRV的cDNA浓度为4.6×102copies/μL。在跟常规RT-PCR检测方法进行对比后得知,新方法的敏感度要比常规RT-PCR方法高100倍。用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV1和猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV2)均为阴性。研究结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,因此对猪群的早期感染体内低病毒拷贝数时都能做出准确的判断,对防治PoRV的暴发能够起到重要作用。 用本实验室分离的猪轮状病毒TM-a毒株对三日龄仔猪进行攻毒试验,此毒株的TCID50为10-6.58/0.1m1,用新建立的荧光定量RT-PCR方法测得病毒液的病毒拷贝数为1.8×106copies/μL。选取PoRV阴性的16头三日龄仔猪,分成4组：空白对照组,口服4μ106TCID50的低剂量组,口服2μ107TCID50的中剂量组,口服1x108TCID50的高剂量组。本研究成功地复制出了轮状病毒感染仔猪的病理模型：高、中、低剂量组分别于第12h、18h、30h采集的粪拭子开始检测到病毒,并且分别于36h、48h、60h开始出现腹泻、呕吐、脱水等症状;通过荧光定量RT-PCR方法检测试验仔猪攻毒后每隔6h的粪拭子PoRV拷贝数,探索猪感染PoRV后的排毒规律,结果表明,随着时间的延长粪样中的病原拷贝数也增加,并且在96h达到峰值1.8×107copies/μL;通过病理组织切片HE染色发现,攻毒组小肠出现严重病变,肠绒毛萎缩变短或脱落,空白对照组无明显变化;同时应用免疫组化法发现病毒主要集中在小肠粘膜上皮和固有层内,尤其以十二指肠段最多。以上研究工作为今后进行PoRV病原诊断试剂的研发、新疫苗的研制和疫苗效果的评价提供了一定的理论依据和物质基础。