乳清蛋白组分分离技术研究及水牛乳乳源蛋白酶水解制备抗菌肽条件优化

作     者：成希飞 

作者单位：暨南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐明芳

授予年度：2013年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083203[工学-农产品加工及贮藏工程] 

主      题：双水相萃取 SDS-PAGE RP-HPLC 层析法 质谱 抗菌肽 

摘      要：本文对亲水有机溶剂/盐双水相体系和PEG/盐双水相体系两种萃取体系对南方水牛乳乳清蛋白的分离纯化进行研究。两种体系表现不同，通过单因素实验可知亲水有机溶剂/盐双水相体系最佳亲水有机溶剂为乙醇，最佳无机盐为碳酸钠。乙醇/碳酸钠体系萃取乳清蛋白，乳白蛋白和乳球蛋白均萃取至上相（乙醇相），用响应面法对萃取条件进行优化，得出最佳萃取条件为：体系碳酸钠质量分数：15.80%、乙醇质量分数：18.73%、pH：12.13，乳清蛋白回收率高达87.89%。并对经双水相萃取的乳清蛋白进行紫外吸收光谱和荧光发射光谱分析，结果表明经双水相萃取乳清蛋白二级结构发生一定变化。研究分析PEG/磷酸盐双水相体系萃取乳清蛋白，分别对PEG种类、PEG质量分数及磷酸盐质量分数进行优化，得出最佳分离条件为PEG1500/磷酸盐双水相体系，PEG1500质量分数为12.4%，磷酸盐质量分数为18.8%，此时乳白蛋白与乳球蛋白分配系数之比达到221.9，乳白蛋白分配在上相（PEG相）而乳球蛋白分配在下相（磷酸盐相）中，通过SDS-PAGE证明PEG1500/磷酸盐双水相体系可基本实现乳白蛋白与乳球蛋白的初步分离。 采用离子交换层析和凝胶层析两步层析法对乳清蛋白进行精分离。硫酸铵60%沉淀乳清蛋白取上清液，上清进一步90%硫酸铵沉淀，取沉淀，蒸馏水溶解后4℃透析过夜，冻干。用蒸馏水调整乳清蛋白溶液浓度为15mg/mL。首先取10mL乳清蛋白溶液过DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析柱，流速0.8mL/min。0.1M、0.15M、0.2M NaCl,0.05MpH6.8Tris缓冲液梯度洗脱。通过SDS-PAGE和RP-HPLC两种方法鉴定可知离子交换层析可以有效分离乳清蛋白中的β-Lg，并且不同的洗脱条件可以获得不同种类遗传变异体的β-Lg，分离效果良好，纯度可达99%。接着，用Sephadex G-75凝胶层析法分离离子交换层析收集液中的α-La和BSA，0.02M pH6.8Tris缓冲液洗脱，流速0.7mL/min。通过SDS-PAGE鉴定，α-La分离效果良好，纯度较高。 针对乳清蛋白中掺入廉价蛋白（大豆蛋白和明胶），采用SDS-PAGE和RP-HPLC两种方法进行检测。两种方法均可有效地将不同蛋白组分分离开来，SDS-PAGE方法得出乳清蛋白中掺入大豆分离蛋白和明胶的最低检测限分别为3.8%和6.96%（m/m），RP-HPLC方法得出最低检测限分别为3.8%和4.97%（m/m）。相比而言SDS-PAGE方法更为直观，可用于初步定性分析。而RP-HPLC方法分离时间较短，根据不同色谱峰保留时间判断蛋白种类，若无明显差异峰则较难判断。而根据保留时间、峰高及峰面积等条件使得分析更为精确，可用于进一步定量分析。 通过LTQ-Orbitrap液-质联用质谱仪对南方水牛乳乳清蛋白两种主要组分α-La和β-Lg氨基酸序列进行研究，搜索数据库获得2种组分的氨基酸的全序列，建立水牛乳乳清蛋白肽指纹图谱。同时分析不同来源的乳清蛋白（山羊奶乳清蛋白和荷斯坦奶乳清蛋白）的氨基酸序列，再与水牛乳乳清蛋白氨基酸序列进行差异性分析。结果表明，水牛乳与荷斯坦奶α-La氨基酸发生变异的部位和比率明显少于山羊奶，而水牛乳β-Lg与荷斯坦奶β-Lg氨基酸发生变异的部位比率要多于山羊奶，说明荷斯坦奶α-La和水牛乳α-La同源性更强;水牛乳β-Lg与山羊奶同源性更强。 水牛乳酪蛋白源抗菌肽的制备及响应面优化中，选取胰蛋白酶的水解条件进行单因子实验和响应面优化实验。单因素实验表明，胰蛋白酶酶解酪蛋白的最佳温度、时间、酶底比分别为：41℃、3h、2%，Box-Behnken响应面的中心组合实验优化结果表明最佳酶解条件为：酶解温度43℃、酶解时间3.4h、最佳酶底比2.5%。酶解产生抗菌肽复合物对大肠杆菌（Escherichia coli, G－）抑菌率可达81.34%。 以上的研究为今后水牛乳乳清蛋白的分离纯化方法奠定一定基础，同时为乳制品、功能性活性肽的工业生产及快速检测乳清蛋白是否掺杂掺假鉴定提供一定理论基础。