抗草鱼呼肠孤病毒药筛选细胞模型及分子检测方法的建立

作     者：安伟 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾令兵

授予年度：2011年

学科分类：09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：草鱼出血病 呼肠孤病毒 CIK细胞 药物筛选 MTT Real-time PCR 

摘      要：草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国重要的淡水养殖品种之一,占我国淡水鱼总产量的20%左右。草鱼以其生长快,饲料来源广及肉质鲜美等优点而深受广大养殖者与消费者欢迎。但是,由于草鱼易患多种疾病,而严重制约了草鱼养殖业的发展,特别是病毒性草鱼出血病,其发病时间长,流行区域广,死亡率高,造成了严重的经济损失。因而,草鱼出血病的防控技术研究一直是科研工作者长期的研究重点。免疫预防方法是预防草鱼出血病最为有效的方法。由于免疫预防技术离大规模生产应用尚有较大的距离,因此,寻找有效的药物来预防和治疗草鱼出血病对草鱼养殖业健康发展有重要意义。 本研究以草鱼肾脏细胞系（CIK）和草鱼呼肠孤病毒（GCRV）为材料,进行抗病毒药物筛选研究。采用四噻唑盐染色法（MTT）方法进行了穿琥宁、板蓝根、黄芩、利巴韦林等药物抗GCRV的效果评价,建立了体外抗GCRV药物筛选的细胞模型。采用实时荧光定量PCR技术,直接检测病毒核酸量的变化评价药物抑制病毒的作用效果,建立了体外抗GCRV药物筛选的分子检测方法。 MTT研究结果,在先给药后感染试验组,穿琥宁在阻断GCRV吸附和侵入细胞时效果最强,其次是利巴韦林和板蓝根,黄芩的阻断效果最弱,其治疗指数分别为810±47,108±13,35.28±8.35和18.08±3.76。在先感染后给药的试验中,穿琥宁利巴韦林和黄芩抑制GCRV增殖的作用显著,治疗指数分别为358±26,555±48和74.2±12.53,板蓝根抑制病毒增殖的作用不明显。在药物与病毒先共同孵育后感染的试验组中,利巴韦林对GCRV有一定直接杀灭作用,其治疗指数为102±16,黄芩、板蓝根和穿琥宁等的体外杀病毒效果不明显。 在分子检测技术中,以GCRV-VP6蛋白编码基因为模板,采用实时荧光定量PCR技术,测定药物试验组与对照组病毒感染细胞后的GCRV-VP6编码基因的拷贝数,先感染后给药的研究结果表明,穿琥宁试验组检测不到GCRV-VP6编码基因,利巴韦林试验组中GCRV-VP6编码基因的相对拷贝数为病毒感染对照组的3.51±0.62%,板蓝根和黄芩试验组的GCRV-VP6相对拷贝数为对照组的25.34±2.48%和34.62±4.18%。分子检测结果与MTT法基本相符。