夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠脊髓中Caspase-3蛋白表达的影响

作     者：郎庆琦 

作者单位：黑龙江中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙远征

授予年度：2017年

学科分类：1005[医学-中医学] 100512[医学-针灸推拿学] 10[医学] 

主      题：夹脊穴 电针 肌萎缩侧索硬化 Caspase-3 ALS-SOD1G93A转基因小鼠 

摘      要：目的:通过夹脊电针干预ALS-SOD1G93A转基因小鼠,观察小鼠的病情进展和生存状态情况,及其对小鼠腰髓前角Caspase-3蛋白表达的影响,为电针夹脊治疗肌萎缩侧索硬化提供实验和理论依据。方法:第一部分实验夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠生存期、疾病进展及行为学的影响:1.实验动物及分组:本实验以ALS-SOD1G93A转基因小鼠为研究动物,以美国Jackson生物科学实验室提供的引物序列和检测标准,在小鼠日龄30d时,对其进行PCR基因鉴定,同时密切观察小鼠病情发展情况。将ALS-SOD1G93A转基因小鼠,按随机数字表法随机分为电针组、手针组和模型组,每组8只。2.干预处理:从日龄60d开始干预治疗:电针组针刺双侧L1～2、L5～6夹脊穴,每一组电极连接同一侧脊椎,电流方向与神经传导束方向相同,频率2Hz,电流1mA,20min/次,2次/周,为期4周;手针组小鼠给予同一时间针刺双侧L1～2、L5～6夹脊穴,不通电;模型组小鼠被捆绑固定、抓握刺激;以上两组干预时间、频率、周期与电针组相同。3.发病与病情进展观察:综合神经功能评分(悬尾试验)、体重测量、转捧试验来观察ALS-SOD1G93A转基因小鼠的发病时间、生存时间、疾病发展等情况。第二部分实验夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠脊髓中运动神经元形态、计数及Caspase-3蛋白表达的影响:1.实验动物分组与处置:ALS-SOD1G93A转基因小鼠18只,按随机数字表法随机分为电针组、手针组、模型组各6只,同窝野生型小鼠6只作为阴性对照,电针组、手针组、模型组处置同第一部分,阴性对照组处置同模型组。2.尼氏染色:尼氏染色观察ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元形态及计数。3.电镜观察:ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元的细胞形态及其内部线粒体的超微结构变化。4.免疫组化:免疫组化法检测ALS-SOD1G93a转基因小鼠腰髓前角Caspase-3 表达。结果:1.运动功能变化分析ALS-SOD1G93A转基因小鼠于日龄90d左右悬尾实验时发生后肢震颤或伸展无力,100-120d左右出现后肢明显萎缩、无力、移动迟缓,140-150d左右小鼠完全瘫痪,自主爬行、进食不能,一般呈侧卧体态。2.发病时间与生存期分析:对比模型组小鼠,电针组小鼠发病向后延迟8d,具显著性差异(P0.05)。与模型组比,手针组、电针组小鼠的生存期各自推迟约5d和10d,差异显著具有统计学意义(P0.05)。5.形态学分析:尼氏染色可见模型组小鼠腰髓前角内多种细胞器出现松散、水肿、空泡化,运动神经元胞体变性、神经纤维消融化。夹脊电针组小鼠运动神经元胞体变性程度明显减轻,尼氏小体的数量和状态与对照组小鼠最接近。6.免疫组织化学法分析:夹脊电针对ALS-SOD1G93A小鼠脊髓中Caspase-3蛋白表达的影响为:单纯针刺夹脊和电针夹脊穴均可下调腰髓前角中Caspase-3的阳性比率。与阴性对照组比较,模型组小鼠腰髓前角Caspase-3的表达显著上升(P0.01);手针组和电针组Caspase-3的变化情况较模型组显著下(P0.05,P0.01),且电针组优于手针组(P0.05)。由此可知,手针和电针均可下调腰髓前角中Caspase-3的阳性比率,且电针效果优于手针治疗。结论:1.夹脊电针可推迟ALS-SOD1G93A鼠发病,延长生存期,改善小鼠病程中运动功能;2.夹脊电针可改善ALS-SOD1G93A小鼠脊髓前角运动神经元大体形态、超微结构及神经元计数的变化;3.夹脊电针抑制ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角Caspase-3的表达,发挥抗凋亡作用,进而保护了运动神经元。