干预Wip1/NF-κB通路对肝脏再生的影响及机制研究

作     者：吴超 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘军

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：肝脏再生 CCT007093 JSH-23 NF-κB Wip1 

摘      要：1研究目的(1)观察Wip1的抑制剂CCT007093和NF-κB的抑制剂JSH-23对C57BL6/J小鼠70%肝切除术后肝脏再生情况的影响。(2)探讨Wip1的抑制剂CCT007093和NF-κB的抑制剂JSH-23对C57BL6/J小鼠再生组织的肝脏中磷酸化的Wip1蛋白浓度情况,研究CCT007093和JSH-23对NF-κB信号通路的相关作用。2实验方法2.1动物模型的建立及分组将购买于山东大学动物中心的45只6-8周大小的C57BL6/J雄性鼠分随机分配为三组:对照组(n=15)、注射Wip1的抑制剂CCT007093组(n=15)和分别注射CCT007093与JSH-23组(n=15)。在同一天分别完成45小鼠2/3肝大部切除术,术后小鼠生存,并且给予充足食物和饮用水,分别在各个实验时间点进行手术,分别收集实验用的小鼠的肝脏,每只小鼠术后肝脏被平分为2份,2份肝脏均存放于液氮中。2.2 Western Blot用蛋白试剂提取盒提取蛋白,检测肝组织中蛋白磷酸化NF-κB水平,增殖细胞核抗原(PCNA)、野生型p53诱导磷酸酶1(Wip1)、雷帕霉素靶蛋白(m-TOR)和cyclin D等蛋白的表达情况。2.3 RT-PCR取液氮中的肝组织,提取总mRNA,检测Wip1mRNA,PCNAmRNA和NF-κBmRNA 水平。2.4数据分析和统计统计分析采用SPSS统计软件(19.0版)和GraphPad Prism 5.0软件。所有数据均表示为x±s,各个组之间的差别应用t检验,以P0.05)在统计学中没有意义如图2。3.2 Wip1抑制剂和NF-κB抑制剂对肝组织PCNA和cyclinD水平的影响Western Blot检测结果表明注射CCT007093组小鼠肝脏组织中PCNA的表达量比在48h与注射CCT007093与JSH-23组中小鼠PCNA的表达量增加(P0.05)无统计学意义如图(3B)。RT-PCR结果表明在注射CCT007093组PCNA的cp值较注射CCT007093 与 JSH-23 组(P0.05)也较高在 36h 如图(3C)。3.3 Wip1抑制剂和NF-κB抑制剂对肝组织p-NF-KB的表达影响Western Blot结果表明在36h注射CCT007093的小鼠p-NF-κB蛋白表达程度与未注射Wip1抑制剂和NF-κB抑制剂小鼠相比增高(p0.01))如图(4B)。RT-PCR结果表明注射CCT007093小鼠NF-κB的cp值较未注射Wip1抑制剂和NF-κB抑制剂小鼠(p0.01)在36h较低。3.4 CCT007093和JSH-23影响肝组织中Wip1的表达Western Blot实验结果显示术后注射CCT007093小鼠Wip1的蛋白水平在48h明显低于未注射Wip1抑制剂和NF-κB抑制剂小鼠的蛋白水平(P0.05)如图(4A)。RT-PCR结果显示术后注射CCT007093小鼠Wip1相对mMRA低于未注射Wip1抑制剂和NF-κB抑制剂小鼠中mMRA相对表达程度在48h(P0.05)。3.5 CCT007093和JSH-23影响肝组织中mTOR蛋白的表达Western Blot实验结果显示术后注射CCT007093小鼠mTOR的蛋白水平明显大于未注射Wip1抑制剂和NF-κB抑制剂小鼠相同时间的蛋白水平程度(P0.05),并且该蛋白活化形式p-mTOR增高在注射Wip1的抑制剂后。4结论(1)通过Wip1直接激活NF-κB磷酸化促进小鼠肝再生。(2)CCT007093可以有效的抑制Wip1的表达促进大部肝组织切除鼠术后的肝增生。(3)JSH-23能抑制NF-κB的表达,并且其磷酸化形式p-NF-κB表达受到抑制。(4)Wip1抑制剂在大部肝组织切除鼠术后可以增加mTOR的