晚期氧化蛋白产物导致THP-1巨噬细胞的氧化应激损伤及药物的干预作用

作     者：毛萍 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨西晓

授予年度：2013年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：晚期氧化蛋白产物 THP-1巨噬细胞 氧化应激 复方黄甘提取物 丹皮酚 

摘      要：1.研究背景 AOPP是Witko-Sarsat等于1996年首次在慢性肾衰竭(CRF)病人血浆中发现的与尿毒症有关的毒素分子,是中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)催化活性氧生成的次氯酸(HClO)作用于蛋白质而形成含有双酪氨酸的蛋白质氧化交联产物。血浆AOPP水平与双酪氨酸、戊糖素、新喋呤等氧化应激标志物呈正相关,与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等抗氧化剂呈负相关,因此AOPP被认为是反映慢性肾衰竭时氧化应激的标志物。其作为氧化应激新的标志物并间接反映着体内氧化应激状态水平,是有一定生物学活性的促炎症反应介质和尿毒症毒素分子,参与慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)和透析患者临床一些并发症发生的病理生理过程。AOPP在体内外均可激发单核细胞的呼吸爆发,刺激单核细胞合成、释放大量促炎性细胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-a等,促发细胞炎症效应,并同时激发中性粒细胞的呼吸爆发,导致更强的氧化应激,正反馈增加自身的形成并增强对单核细胞的效应,进而造成全身微炎症状态。已经证实,AOPP是一种促炎症和促氧化应激介质,单核／巨噬细胞作为体内炎症细胞因子和氧化剂的主要来源是它选择性作用的靶细胞。 尿毒清颗粒是南方医院研制的抗肾衰产品,能有效减轻CRF病人的临床症状,改善肾功能,延缓肾功能减退。复方黄甘颗粒是尿毒清颗粒的第二代产品,本实验室前期的动物体内实验表明,复方黄甘提取物能显著性地降低CRF大鼠循环中氧化物质AOPP的含量,减轻CRF大鼠的氧化应激反应,但其具体的作用机制尚需进一步探讨。 丹皮酚(Paeonol, Pae)又称牡丹酚,是中药材毛莨科植物牡丹(Paeonia Suffruicosa Andr)根皮和萝摩科植物徐长卿[Pycnostelma Paniculatum(Bunge) K. Schum]干燥根或全草的主要有效成分。大量研究表明,丹皮酚具有抗炎、抗变态反应、免疫调节等作用,对脾脏、胸腺等免疫器官及淋巴细胞、单核细胞等免疫分子均具有明显的免疫调节作用,同时具有抗氧化、抗菌抗肿瘤、保护心血管、镇静催眠及解热镇痛等广泛的药理作用。但其是否会影响巨噬细胞的免疫调节还不太清楚。 本次实验旨在通过体外人工合成AOPP,刺激THP-1巨噬细胞后,用于研究复方黄甘提取物及丹皮酚对其氧化应激损伤的影响及其可能的机制。 2.研究方法 2.1无内毒素AOPP修饰蛋白的制备与鉴定 将无内毒素的牛血清白蛋白(BSA)与次氯酸钠(NaCIO)以1/70、1/140、1/280的摩尔比例混合均匀,室温反应30min,制备出三种不同修饰程度的AOPP。按照Witko-Sarsat等的紫外分光光度计法,于酸性条件下,340nm测定AOPP对氯胺-T的相对浓度(μM);Bradford法于595nm处测定AOPP制品和对照BSA样品中总蛋白的含量(mg/ml);凝胶法鲎试剂(灵敏度0.25EU/ml)定性检测AOPP制品中内毒素的含量。 2.2复方黄甘提取物及丹皮酚对AOPP诱导THP-1巨噬细胞氧化应激损伤的影响 2.2.1THP-1巨噬细胞的诱导分化 以160nM的不含血清的PMA溶液刺激人THP-1单核细胞株24h后使之转化成THP-1巨噬细胞。 2.2.2复方黄甘提取物及丹皮酚对THP-1巨噬细胞活力的影响 用MTT还原法测定细胞活性。不同修饰程度不同浓度的AOPP与细胞共同培养24h后,于多功能酶标仪570nm处测定细胞活力。AOPP预处理巨噬细胞24h,弃去培养上清,再用复方黄甘提取物及丹皮酚继续培养24h,测定细胞活力。 2.2.3复方黄甘提取物及丹皮酚对AOPP诱导的THP-1巨噬细胞NO产生的影响 不同修饰程度不同浓度的AOPP与THP-1巨噬细胞共同孵育24h,收集上清,用Griess试剂法测定培养上清亚硝酸盐的含量,间接反映NO的产生量。AOPP与巨噬细胞共同培养24h,复方黄甘提取物和丹皮酚分别干预处理24h,用Griess试剂法测定培养上清NO浓度。荧光定量PCR测定iNOS的基因表达。 2.2.4复方黄甘提取物及丹皮酚对AOPP诱导的THP-1巨噬细胞ROS、炎性因子产生的影响 不同修饰程度不同浓度的AOPP与THP-1巨噬细胞共同孵育24h,培养结束后用对ROS敏感的荧光探针DCFH-DA标记细胞,用多功能酶标仪在λex=485nm、λem=535nm下测定细胞经不同刺激后细胞内氧化DCFH产生的荧光量,即细胞内ROS的产生量。复方黄甘提取物和丹皮酚分别预处理0.5h、1h和2h,AOPP与巨噬细胞继续培养24h;在阻断实验中,细胞分别与自由基清除剂NAC, NADPH抑制剂apocynin、DPI,NF-кB抑制剂PDTC等37℃避光孵育0.5h、1h和2h后再用AOPP刺激24h