酸性丝氨酸蛋白酶对人慢性髓性粒细胞株K562细胞作用的初步研究

作     者：薄其青 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：洪敏

授予年度：2012年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：ASPNJ K562 慢性髓性粒细胞白血病 凋亡 坏死 Bax mRNA 

摘      要：酸性丝氨酸蛋白酶对人慢性髓性粒细胞株K562细胞作用的初步研究目的：酸性丝氨酸蛋白酶（Acidic Serine Protease from Neanthes japonica,ASPNJ）是本实验室从我国北方沿海海洋生物沙蚕体内提纯得到的一种蛋白酶，因其对纤维蛋白及纤维蛋白原有很强的溶解作用，故曾命名为沙蚕纤溶酶，其本质是酸性丝氨酸蛋白酶。具有纤溶活性的一类蛋白酶如蚓激酶对多种肿瘤细胞有显著的杀伤作用，受到基础和临床研究的重视。然而，ASPNJ对肿瘤细胞的作用及作用机制至今没有被研究。本论文报告ASPNJ对慢性髓性粒细胞白血病K562的体外抗肿瘤作用，并做了初步的机制研究，探讨临床应用的可能性，可能为抗白血病研究与治疗提供一个新的思路。 方法： 1、以体外培养的慢性髓性粒细胞白血病K562细胞株为本实验模型;2、MTT比色法检测ASPNJ对K562细胞的增殖抑制作用;3、倒置显微镜、瑞氏-吉姆萨染色法及激光共聚焦显微镜联合流式细胞术观察ASPNJ作用K562细胞后其形态学的改变及凋亡情况;4、PCR检测Bax mRNA的表达，以β-actin为内参，观察ASPNJ作用于K562细胞后，与凋亡有关的部分基因表达状况;5、观察ASPNJ与多柔比星联合作用于K562细胞的增效作用;6、观察ASPNJ对人正常红细胞溶血、凝聚作用及MTT比色法检测对粒细胞的作用;结果： 1、ASPNJ对K562细胞有明显的增殖抑制作用，呈现出时效-量效关系;2、倒置显微镜、瑞氏-吉姆萨染色法观察形态学变化，可见ASPNJ作用K562细胞后，部分细胞出现明显的凋亡改变，包括核固缩、核碎裂等，部分细胞呈现显著的坏死现象，或同时有凋亡改变也有坏死改变;3、激光共聚焦显微镜下，可见典型的细胞膜绿色，胞核红色的形态变化;激光共聚焦及流式细胞术可明显检测到ASPNJ对K562细胞产生的凋亡作用与坏死作用;4、PCR结果显示：随着ASPNJ作用剂量及时间的增加，Bax基因表达逐渐增高;5、ASPNJ与盐酸多柔比星联合用药，有显著的肿瘤抑制增效作用;6、ASPNJ对人体正常红细胞无溶血作用，也无凝聚作用;7、ASPNJ对人正常粒细胞没有显著的增殖抑制作用。 结论： 1、ASPNJ能抑制K562细胞增殖，其作用呈现一定的时效和量效关系，ASPNJ促使K562细胞凋亡和坏死;2、ASPNJ可能通过上调Bax mRNA的表达来诱导K562细胞凋亡，可能通过破坏K562细胞膜完整性引起细胞坏死;3、与盐酸多柔比星共同作用，有显著的增效作用;4、ASPNJ对正常人白细胞作用远远低于K562细胞，在6小时内不引起溶血和凝聚