IgG结合结构域重组蛋白A表达、纯化及鉴定

作     者：毛未贤 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙德军

授予年度：2010年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：SPA 表达 大肠杆菌表达系统 纯化 

摘      要：金黄色葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A、简称SPA或蛋白A)是细胞壁抗原的主要成分。SPA能与人及多种哺乳动物血清IgG分子结合,因而成为免疫学上一种极为有用的工具。SPA分子含有E、D、A、B、C 5个高度同源的且与IgG结合能力不同的结构域。 本研究从SPA分子中的IgG结合结构域中选取了与IgG结合能力较强的D、A、B三个结构域,设计全长为690bp的重组基因序列,与pUC57载体连接后,克隆至大肠杆菌DH5α,构建克隆重组菌。SPA基因经扩增和酶切鉴定后,与pGEX-2T表达载体连接,重组质粒pGEX-SPA转化大肠杆菌BL21中,IPTG诱导融合蛋白GST-SPA表达,SDS-PAGE对蛋白表达结果进行检测,表达产物中含有分子量约为54kD的目的蛋白GST-SPA。通过对表达条件的优化,结果显示重组大肠杆菌BL21菌体在OD600为0.8,IPTG的终浓度为0.6mmol/L,37℃诱导表达3h的条件下,目的蛋白表达量最高。菌体超声破碎后,超声上清中的可溶性重组蛋白和经复性处理后的超声沉淀包涵体中的重组蛋白分别通过GST-Sepharose 4B亲和层析进行纯化,得到纯度较高目的蛋白GST-SPA。经琼脂免疫扩散实验进行活性测定,证明重组蛋白GST-SPA具有IgG结合特性。 本研究成功地在大肠杆菌中高效表达并纯化出高纯度的具有IgG结合特性的pGEX- SPA重组蛋白,为利用基因工程技术生产重组SPA开辟了一条新的途径。