鹦鹉热衣原体MIP蛋白对宿主细胞产生前炎症细胞因子和凋亡的影响

作     者：符玺宗 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈丽丽

授予年度：2017年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：鹦鹉热衣原体 巨噬细胞感染增强因子(Microphageinfectivity potentiator,MIP) IL-8 TNF-α 凋亡 

摘      要：目的:研究鹦鹉热衣原体巨噬细胞感染增强因子(Microphage infectivity potentiator,MIP)诱导人单核细胞(Human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)产生前炎症细胞因子和对He La细胞凋亡的影响,为进一步探索Cps感染致病的分子机制提供实验依据。方法:PCR扩增MIP基因,克隆至pET-30a(+),构建原核表达载体pET-30a(+)/MIP,IPTG诱导p ET-30a(+)/MIP在*** BL21中表达目的蛋白,SDS-PAGE进行分析和鉴定。用多粘菌素B去除内毒素后,用不同浓度的重组Cps MIP刺激THP-1细胞,ELISA法检测经刺激后的THP-1细胞产生的IL-8和TNF-α水平,并检测Cps MIP刺激THP-1细胞不同时间后所产生的前炎症细胞因子IL-8和TNF-α的量。用重组Cps MIP处理HeLa细胞,荧光染色法和流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果:PCR扩增得到大小约为768 bp左右的Cps MIP目的片段;经PCR、酶切及测序鉴定,证明构建的原核重组质粒中插入的片段为Cps MIP基因,测序结果经BLAST分析,与Genbank上登录序列完全一致。重组载体经IPTG诱导,表达相对分子量(Mr)约为34 kD的Cps MIP蛋白。超声裂解后,SDS-PAGE分析目的蛋白在菌体细胞内以可溶性形式表达,用HIS纯化树脂纯化后,获得纯度95%以上的重组蛋白。重组Cps MIP能以时间、剂量依赖方式诱导THP-1细胞分泌前炎症细胞因子IL-8和TNF-α。当Cps MIP的浓度为16μg/mL时产生的IL-8和TNF-α量最多,分别为105.01 pg/mL和50.52 pg/mL;48 h内,Cps MIP刺激THP-1细胞产生IL-8和TNF-α的量随着时间延长而不断增加。荧光染色法和流式细胞术检测细胞凋亡率,发现Cps MIP处理的HeLa细胞凋亡率明显降低。结论:1.成功克隆Cps MIP基因并构建了pET-30a(+)/MIP原核表达载体,转化至*** BL21后能高效表达出相对分子质量约34kDa的Cps MIP蛋白;*** MIP蛋白能诱导THP-1细胞表达并分泌前炎症细胞因子IL-8和TNF-α;*** MIP具有抑制HeLa细胞凋亡的作用。