PM2.5引起急性肺炎的机制探讨及复方精油对其抗炎效果研究

作     者：王鹤潼 

作者单位：大连医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李发胜

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：PM2.5 急性肺炎 复方精油 免疫反应 小鼠 

摘      要：目的:PM现已成为当今社会的热门话题,然而PM所致肺炎的机制仍不清楚。此外,目前尚无成熟的针对PM所致肺炎的治疗方法。该研究旨在探讨PM所致急性肺炎的潜在机制,并探讨复方精油疗法在治疗PM所致肺炎方面的作用。方法:1.复方精油成分分析:气相色谱-质谱分析法检测复方精油化学成分及含量;2.PM样品采集、成分分析及预处理:大流量采样器收集了2013年1月至3月期间河北廊坊地区PM颗粒物,并分析样品组成成分。将载有PM颗粒物的超细石英纤维滤膜于无菌水中超声处理2 h,所得悬液经真空冷冻干燥处理后,称取一定量颗粒物用无菌生理盐水配置成浓度为10 mg/m L的PM悬液用于构建小鼠急性肺炎模型;3.实验动物分组及模型构建:96只6-8周的雄性Balb/c小鼠随机分为四组,实验期间所有动物自由进食进水。空白对照组小鼠分别在实验第0、2天施气管滴注50μL无菌生理盐水;PM染毒组小鼠分别在实验第0、2天施气管滴注50μL 10mg/m L PM悬液;PM+生理盐水组小鼠分别在实验第0、2天施50μL10mg/m L PM悬液染毒,并于染毒前一天起,静态吸入200μL生理盐水,每天一次,每次30 min;PM+复方精油组小鼠分别在实验第0、2天施50μL 10mg/m L PM悬液染毒,并于染毒前一天起,静态吸入200μL混有2滴复方精油的生理盐水,每天一次,每次30 min;4.肺炎相关指标检测:分别于PM染毒后第3、7、14天处死小鼠,提取小鼠肺组织、肺泡灌洗液、脾组织及血清。将肺组织进行苏木精-伊红(H&E)染色,观察其形态学及病理学改变;定量PCR法检测肺组织IL-1β、TLR4、My D88、Nf-κB、NLRP3、P2X7基因表达水平;免疫组织化学染色检测肺组织TLR4、NLRP3蛋白表达水平;取肺泡灌洗液进行总细胞数计数、细胞分类计数;ELISA法检测肺泡灌洗液内IL-1β蛋白浓度;5.Th免疫相关指标检测:定量PCR法检测了小鼠脾组织Th1、Th2、Th17、Treg型细胞转录因子T-bet、GATA3、ROR-γt、Foxp3的基因表达水平;ELISA法检测血清内Th1型、Th2型细胞因子IFN-γ、IL-4的蛋白浓度。结果:1.复方精油成分:在复方精油中共检测到25种化合物。其中桉叶素(16.7%)、α-蒎烯(16.54%)及薄荷醇(12.86%)为其主要成分;2.PM成分:所采集PM样品中,碳成分为有机碳、元素碳,主要的水溶性离子为NH4+、NO3-及SO42-,金属元素主要为Ca、Na、Al及Mg,多环芳烃类化合物主要有荧蒽、芘及苯丙荧蒽;3.病理学结果:PM染毒组与空白对照组相比,小鼠暴露于PM后,在三个时间点上均可见肺泡结构破坏、白细胞聚集等病理学改变;PM+复方精油组小鼠较PM+生理盐水组小鼠可见明显肺泡壁结构破坏减少、白细胞聚集现象减轻,并存在一定时间依赖性;4.肺泡灌洗液细胞计数结果:PM染毒组较空白对照组细胞总数显著增高,淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞明显增多;PM+复方精油组较PM+生理盐水组细胞总数显著降低,淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞明显减少;5.肺炎相关指标表达量改变:PM染毒组与空白对照组小鼠在三个时间点均可见IL-1β、TLR4、My D88、Nf-κB、NLRP3、P2X7基因表达上调,IL-1β、TLR4、NLRP3蛋白表达增多;PM+复方精油组小鼠较PM+生理盐水组小鼠在三个时间点上均可见IL-1β、TLR4、My D88、Nf-κB、NLRP3、P2X7基因表达下调,IL-1β、TLR4、NLRP3蛋白表达减少;6.脾组织T细胞转录因子及血清炎症因子表达结果:PM+复方精油组较PM+生理盐水组相比,脾组织T-bet、GATA3、ROR-γt、Foxp3基因表达显著下调,血清Th1型、Th2型细胞因子IFN-γ、IL-4蛋白浓度降低。结论:PM可能通过活化TLR4/My D88通路及NLRP3炎症小体引起IL-1β表达增加,进而引起小鼠急性呼吸道炎症的发生;复方精油可能通过抑制TLR4/My D88通路及NLRP3炎症小体活化减少IL-1β表达并抑制Th免疫反应从而减轻了PM所致的急性肺炎。该研究探讨了PM所致急性肺炎的潜在机制,并为PM相关的炎症性疾病提供了全新的治疗方法。