类泛素化修饰抑制剂MLN4924通过阻止BRCA1复合体募集抑制DNA双链断裂修复

作     者：郭宗培 

作者单位：中国人民解放军军事医学科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：周平坤;马腾

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：Neddylation BRCA1 PARP1 非小细胞肺癌 DNA 双链断裂 

摘      要：DNA双链断裂是DNA损伤最严重的形式,对此,细胞主要通过两种修复途径来应对:非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组(homologous recombination,HR)。细胞选择NHEJ途径进行修复时不需要模板,所以在细胞周期全过程都可以发生,在G1期尤为显著,是一种错误倾向性修复;HR修复过程需要同源的姐妹染色单体为模板合成新的DNA链,因此只有处于S期和G2期的细胞才有可能通过此途径进行修复,是一种无错修复方式。乳腺癌相关基因1(breast cancer associated gene 1,BRCA1)是HR修复通路中的重要蛋白,它除了能够修复损伤的DNA外,还可以激活细胞周期检查点,是一种关键的抑癌基因。据之前报道,类泛素化(Neddylation)反应可以调节DNA损伤修复过程,并且可能通过影响BRCA1来发挥作用。为了更深入研究Neddylation对BRCA1的影响,我们在本研究中使用了MLN4924这个小分子抑制剂。MLN4924是一种有效且特异的NEDD8的小分子抑制剂,它能够与NEDD8活化酶形成复合物,进而有效且特异地抑制NEDD8对目的蛋白的修饰。考虑到NEDD8是一种类泛素,它可能会通过修饰BRCA1蛋白,进而调节同源重组修复通路。于是我们首先通过Pull-down实验来验证此假设,结果显示NEDD8并不能修饰BRCA1,但这并不代表对BRCA1没有影响。接着我们用Neddylation活化酶抑制剂MLN4924特异性抑制Neddylation反应,探讨Neddylation对BRCA1复合体的影响。结果显示Neddylation反应被抑制以后,BRCA1复合体中的蛋白组分,包括RAP80、BARD1以及BRCA1在DNA断裂位点的募集明显被抑制,这说明MLN4924对DNA的同源重组修复通路产生影响。同样PARP的抑制剂也能抑制同源重组修复,于是我们考虑MLN4924可能与PARP的抑制剂Olaparib协同作用来抑制DNA的同源重组修复,进而抑制DNA受损的肿瘤细胞的生长。为验证这一设想,我们联合MLN4924与Olaparib预处理A549和H1299两种非小细胞肺癌细胞系,然后通过细胞增殖与毒性实验(cell counting kit-8,CCK8)检测两种细胞的增殖,结果如我们所预料,两者联合用药相比单独用药更有效地抑制了这两种非小细胞肺癌细胞系的生长。进一步我们通过检测DNA双链断裂分子标志物γH2AX,发现两者联合用药处理细胞后,细胞内γH2AX增加的量以及残留时间相比单独用药或者不用药处理时都有显著增加,说明实验组中DNA的修复过程被严重抑制。最后我们用Kaplan-Meier绘制出肺癌病人的预后情况与NEDD8、PARPs、BRCA1三者的表达量的关系,结果呈负相关性。这些现象提示我们MLN4924与Olaparib联合用药可能会成为治疗非小细胞肺癌的新策略。目的1.利用MLN4924特异性抑制Neddylation反应,检测经IR处理后人骨肉瘤细胞中BRCA1复合体部分组分蛋白在DNA损伤位点的募集情况,进而探讨Neddyaltion修饰对BRCA1复合体的影响;***4924和Olaparib联合处理A549和H1299,观察联合用药对两种细胞系增殖的影响,进而探讨两者联合用药治疗非小细胞肺癌的可能性;3.通过检测γH2AX的量及其在细胞中存在的时间长短来确定MLN4924与Olaparib联合用药会更大程度地影响DNA修复,进而使细胞生长受到更显著的抑制;4.用Kaplan-Meier数据库来宏观地判断NEDD8、PARPs、BRCA1三者表达量与肺癌病人预后情况的关系。方法分别转染SFB空载质粒(SFB-VEC)、SFB-NEDD8野生型质粒(SFB-NEDD8WT)以及SFB-NEDD8突变型质粒(SFB-NEDD8 Mut)于293T细胞,24h后,荧光显微镜下检测有绿色荧光,然后进行10Gy照射,收集照射后1h的细胞,做Pull-down实验,检测NEDD8是否修饰BRCA1蛋白;用终浓度为3μM的MLN4924预处理U2OS细胞1h,8Gy照射,免疫荧光实验检测照射后6h细胞内BRCA1的焦点;以Lipofectamin2000为转染试剂,分别转染GFP-BARD1和GFP-XRCC1两种质粒到U2OS细胞,24h后利用激光微照射方法对DNA造成损伤,荧光显微镜下观察GFP荧光强度并拍照;用终浓度为3μM的MLN4924预处理U2OS细胞1h,照射(8Gy),然后依次收集照射后1、2、4、8和12h的细胞沉淀,用0.2M HCL提取细胞染色体组分蛋白,以Lamin-C为内参,通过免疫印迹法检测募集到染色体上