微杆菌Microbacterium ***4-1尿酸氧化酶基因的克隆表达及重组酶性质的研究

作     者：张鹏程 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马晓航;赵宇华;贾小明

授予年度：2012年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：微杆菌 重组尿酸氧化酶 基因克隆 表达优化 纯化 酶学特性 

摘      要：尿酸氧化酶（Urate oxidase, Uox, Uricase, EC 1.***.3.3）能降解尿酸,已广泛用于临床检测和治疗。本实验室于2005年分离到一株产Uox的微杆菌Microbacterium sp. ZZJ4-1菌株,其Uox具有优异的热稳定性。本研究克隆了该酶基因（uox）,构建了重组表达菌株,在优化诱导表达条件后纯化了重组酶,并对其主要性质进行研究。本研究的主要成果如下： 1、成功克隆Microbacterium sp. ZZJ4-1的uox。测序表明其开放阅读框为894 bp （GenBank登录号为JQ066818）,编码297个氨基酸。该基因与多数已报道的uox无明显同源性,仅与球形节杆菌Arthrobacter globiformis的uox有72%的同源性。将基因插入质粒pET-15b构成pET-15b-uox表达载体,转化至Escherichia coli BL21（DE3）,成功构建重组表达菌株。 2、对影响诱导表达的因子（山梨醇浓度、诱导前生物量、IPTG浓度、诱导时间和诱导温度）进行优化,最终确定条件为：接1%过夜培养的种子菌液于含100 mg/L氨苄青霉素,不含山梨醇的TB培养基中,37℃培养至OD600约为3.5,力口IPTG至0.5mmol/L,22.5℃诱导表达18 h。优化后粗酶液酶活提高30.6倍。 3、重组酶经两步纯化后纯度提高14.5倍。SDS-PAGE电泳显示为单一条带,比活可达4.6 U/mg,回收率达47.8%。重组酶由大小约为35 kDa的亚基组成;其最佳反应温度和pH分别为30℃和7.5;在65℃以下和pH 8.5-11.0范围内稳定;以尿酸为底物的Km值为0.2mmol/L;Ag+、Zn2+、Cu2+和SDS均能完全抑制酶活,Tween 20、Tween 80和Triton X-100对酶活有一定的促进作用。NaN3和金属螯合物1,10-菲罗啉、EDTA轻微抑制酶活。本研究结果表明该重组Uox是目前已报道的热稳定性最好的重组酶。