微小蛋白质内含子和新型断裂蛋白质内含子的定向进化

作     者：邱沛然 

作者单位：东华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孟清;刘相钦

授予年度：2013年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：蛋白质内含子 定向进化 易错PCR 蛋白质剪接 

摘      要：蛋白质内含子（intein）可视为RNA内含子的蛋白质等价物,是一段位于宿主蛋白质前体中的插入序列,连接在其两端的蛋白质序列称为蛋白质外显子（extein）。根据蛋白质内含子的结构特征可将其分为三类：标准型蛋白质内含子、微小型蛋白质内含子和断裂型蛋白质内含子。在宿主蛋白质的成熟过程中,蛋白质内含子可以催化自身从蛋白质前体中剪切下来,同时将两侧的外显子以肽键连接,这种蛋白质翻译后的成熟过程称为蛋白质剪接（protein splicing）。蛋白质剪接技术为在蛋白质水平上直接对蛋白质进行修饰和加工提供了一种全新的解决方案,因而在蛋白质工程及相关领域具有非常广阔的应用前景。 现阶段,大部分天然的蛋白质内含子在异源蛋白质中剪接活性非常低，极大限制了蛋白质内含子的开发和应用。虽然已经获得Ssp DnaB、Ssp DnaE及Mxe GyrA等蛋白质内含子的晶体结构,但是对其结构和剪接功能之间的关系仍所知甚少,这就使得通过理性设计的方法来提高异源蛋白质中蛋白质内含子的剪接活性变得十分困难。 在本研究中,将蛋白质内含子编码基因插入到卡那霉素抗性蛋白基因中,使蛋白质内含子剪接活性与卡那霉素抗性相结合,构建基于卡那霉素抗性的筛选系统。分别选择Ter ThyX（TX）和Ter DnaE-3（TE3）两个蛋白质内含子的微小型、S1型和S11型插入到卡那霉素抗性蛋白基因的多个位点,在成功的验证该系统可行性的同时,也为定向进化筛选合适的进化位点。结果表明TX微小型蛋白质内含子在卡那霉素抗性蛋白的多个位点均具有较高的剪接活性,而S1和S11型对应的剪接活性则明显较低,其中S1型蛋白质内含子只在卡那霉素抗性蛋白中的一个位点有较弱的剪接活性,S11型蛋白质内含子在所有位点均无剪接活性。对于TE3蛋白质内含子而言,除了微小型蛋白质内含子在其中 个位点有微弱的剪接活性之外,S1和S11型内含子在所有位点均没有剪接活性。在下一步试验中,利用易错PCR作为进化手段,构建了菌落数超过106的突变库,经过两轮筛选在抗性平板上获得了9个提高了剪接活性的突变株。western blot结果显示：经过进化后的TE3微小内含子在该系统中的剪接活性从20%提高到了超过60%。结合蛋白质内含子的结构信息分析各处突变,其中E71D（Glu突变为Asp）这个突变可能位于蛋白质内含子与N端外显子接触区,而D的侧链比E要短,由此分析可能是因为D为N端外显子提供了更大的空间使得蛋白质内含子的剪接活性提高。对于TX内含子,本研究尝试对其S1和S11型内含子进行定向进化,可能是由于其本身溶解性的原因,未能取得阳性克隆。 本研究通过定向进化技术成功提高了蛋白质内含子的剪接活性,为蛋白质内含子的应用提供了丰富的资源。分析高剪接活性突变体的结构信息,为研究蛋白质内含子结构和功能之间的关系带来更多的信息和新的启示。随着在结构和功能方面的进一步研究,蛋白质内含子将得到更广泛的应用,为蛋白质工程研究开辟新的途径。