卵巢上皮癌侧群细胞（side population,Sp）研究

作     者：孟泳圳 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李力

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肿瘤干细胞 SP细胞 卵巢癌 流式细胞仪 Hoechst33342 表面标志物 荧光定量PCR 生物学特性 化疗抵抗 细胞凋亡 多药耐药基因 

摘      要：第一章卵巢上皮癌侧群细胞(side population, SP)研究进展 肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSC)被认为是肿瘤产生,耐药和复发的根本原因。SP细胞是肿瘤干细胞研究的主要方法之一,在肿瘤的发生和发展中可能起了重要作用。本章节就干细胞、侧群细胞以及肿瘤干细胞的起源和相互关系,卵巢癌干细胞及SP细胞的生物学特征,卵巢癌干细胞及SP细胞表面标志研究近况,SP细胞在卵巢上皮癌多药耐药发生发展中的作用及分子机理以及针对卵巢癌干细胞新的靶向治疗策略进行综述。 第二章卵巢癌侧群细胞流式分选方法的建立及探讨 目的：探讨分选卵巢癌细胞株SKOV3中的侧群(side population, SP)细胞的最佳染料浓度和细胞密度,建立分选SP细胞的技术路线。 方法：制备SKOV3单细胞悬液,以荧光染料Hoechst33342和7-AAD染色,维拉帕米拮抗对照,选择不同浓度的(2.5、3.4、5、6mg/L) Hoechst33342孵育1×106个/mlSKOV3细胞90min,流式细胞仪检测SP细胞比例及活细胞比例;选取不同细胞密度的(6×105,7×105,8×105,9×105,1×106个/ml) SKOV3细胞悬液,3mg/L的Hoechst33342孵育90min,流式细胞仪检测SP细胞比例及活细胞比例。 结果：通过Hoechst33342蓝光和红光双参数图,SP细胞位于左下角两种荧光均很弱的区域。Hoechst33342浓度不变时,SP细胞比例随细胞密度的增加而升高;SKOV3细胞密度不变时,SP细胞比例及细胞活性随hoechst33342浓度升高而降低。卵巢癌SKOV3细胞株在细胞密度为8×105个/m1,加入终浓度为3mg/L的Hoechst33342,37℃水浴90min,为最佳染色条件,此时SP细胞比例为(1.12±0.104)%,且细胞保持良好的活性。 结论：建立了分选人卵巢癌细胞株SKOV3中存在SP细胞的最佳实验条件,为分选其他肿瘤组织或细胞株中的SP细胞建立了参照标准。 第三章卵巢癌SKOV3细胞中SP细胞中卵巢癌干细胞相关表面标志物表达 目的：检测卵巢癌SKOV3细胞系中SP和NSP细胞中卵巢癌干细胞相关标志物和基因表达差异。 方法：荧光染料Hoechst33342和荧光标记抗体共染染SKOV3细胞,流式细胞仪检测SP和NSP细胞中ALDH2, CD90, CD133, CD117, ABCG2, CD44表达;荧光定量PCR检测SP和NSP细胞中NANOG, ALDH2,, CD133, ABCG2, SOX2, CD117基因在表达差异。 结果：流式细胞仪检测SP和NSP细胞中CD90、CD133、CD117、CD44阳性表达差异无统计学意义。SP和NSP细胞中ALDH2和ABCG2的阳性表达分别为87.3±5.76%、29.48±4.43%、5.32±0.47%、3.01±1.69%,差异有统计学意义P0.05。 荧光定量检测结果表明SP和NSP细胞中ABCG2表达均较高且表达有差异,SP细胞中CD117表达高于NSP细胞,SP细胞中CD133表达低于NSP细胞,SP和NSP细胞中ALDH2表达没有差异。SP细胞与NSP细胞比较,SOX2高表达,OCT4低表达,NANOG在两者之间表达没有差异。 结论：ABCG2是SP细胞的表面标志物,SOX2和ALDH2可能是卵巢癌干细胞潜在的表面标记。 第四章卵巢癌SKOV3细胞中SP细胞的生物学特性测定 目的：通过流式细胞仪分选卵巢癌细胞系SKOV3中的SP细胞和NSP细胞,并研究其生物学特性。 方法：通过MTT生长曲线和平板集落形成实验比较SP及NSP细胞的增值能力和克隆形成能力,SP细胞连续分选培养检测自我更新能力,transwell法比较SP及NSP细胞侵袭及迁移能力,流式细胞仪对SP及NSP细胞进行周期分析。 结果：SP与NSP细胞的生长速度在前5天没有差别,第6天和第7天,SP细胞生长速度快于NSP细胞,差异有统计学意义(P0.05)。接种SP和NSP细胞数目为800,400,200个时,集落形成率分别为8.9±1.1%、10±2.3%、12±1.5%和1.7±0.2%、1.75±0.5%、3.0±0.8%,相同接种细胞密度下SP细胞的集落形成能力大于NSP细胞(P0.05)。SP细胞较NSP细胞有更强的侵袭和迁移能力,其中侵袭细胞数目分别为60±5和34±4,迁移细胞数目分别为91±6和74±4,差异有统计学意义(P0.05)。SP细胞具有自我更新能力,在培养后产生NSP细胞。SP大多处于静止期(G1期比例69.94±5.39%。 结论：卵巢癌细胞系SKOV3中的SP细胞具有肿瘤干细胞生物学特性,SKOV3中的SP细胞富含卵巢癌干细胞。 第五章卵巢癌SKOV3细胞中SP细胞与其多药耐药的关糸初步实验研究 目的：通过比较SP与NSP细胞对化疗药物敏感性及耐药基因表达差异,探讨SP细胞与卵巢癌多药耐药的关系。 方法：MTT法检测SP,NSP及SKOV3细胞对化疗药物顺铂、卡铂、阿霉素和紫杉醇的半数抑制浓度(IC50)和耐药指数(RI)。流式细胞仪检测不同卡铂浓度下(0.02mg/ml,0.08mg/ml,0.12mg/ml) SP和NSP细胞凋亡差异,荧光定量PCR检测SP、NSP和SKOV3细胞中细胞耐药相关基因ABCG2、BCL-2和ABCB1基因表达。高效液相色谱法检测SP和NSP细胞内药物浓度。 结果：SP细胞对化疗药物卡铂、顺铂及紫杉醇有较高的耐受性,对NSP细胞耐药指数分别为1.62±0.06、1.72±0.06、1.31±0.22、1.36±0.06,差异有统计学意义。细胞凋亡实验结果显示SP细胞有较强的抗凋亡能力,卡铂终浓度为0.08mg/ml和0.120mg/ml时,SP和NSP细胞凋亡率分别为26.88±2.49%、33.83±4.13%和43.93±3.44%、65.52±4.30%,差别有统计学意义P0.05。荧光定量PCR结果显示,BCL-2基因在SP细胞中表达较NSP和SKOV3低,差异有统计学意义。ABCB1基因在SP细胞中相对表达量为2.340±0.306,高于NSP和SKOV3细胞,差异有统计学意义。ABCG2基因在SP中表达较NSP细胞高,但差异没有统计学意义。ABCG2基因在SKOV3细胞中相对低表达,较SP和NSP细胞中表达差异有统计学意义(P0.05)。顺铂浓度为4μg/mL和8μg/mL作用细胞48小时,高效液相检测NSP细胞中顺铂蓄积量分别是SP细胞的1.5倍和2.8倍。 结论：卵巢癌SP细胞高表达ABC转运蛋白家族多药耐药基因,具有较高的化疗药物抵抗能力和抗凋亡能力。