小蓟饮子及其配伍对关木通肾毒性的减毒作用及机理研究

作     者：林玲 

作者单位：湖北中医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：巴元明

授予年度：2007年

学科分类：100504[医学-方剂学] 1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 1005[医学-中医学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：配伍 关木通 肾毒性 研究 小蓟饮子 

摘      要：目的： 通过体内外实验，研究小蓟饮子及其配伍对关木通肾毒性的减毒配伍途径及可能的减毒机理。 方法： 体内实验 将大鼠随机分为7个组，分别给予生理盐水、关木通水煎液、小蓟饮子水煎液、关木通与小蓟饮子中君、臣、佐、使不同配伍的水煎液灌胃，3周后，观察各组大鼠的一般情况，测定相关肾功能指标并对肾组织形态学进行观察。 体外实验 1对关木通对照组、小蓟饮子组、体内实验可能筛选出的有效减毒配伍组，用高效液相色谱法测定各组中马兜铃酸Ⅰ(AAⅠ)的含量。根据关木通对照组中AAI的浓度，分别配制与之浓度相一致的各组实验药液。 2应用体外细胞培养技术，进行人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)的培养。 3建立不同浓度关木通(按其中所含AAⅠ计算)所导致的HK-2细胞凋亡模型，并确定一理想浓度进行减毒机理研究。 4各组药液分别加入体外培养好的HK-2细胞中。每隔4小时观察细胞形态改变，24小时后于倒置显微镜下观察并照相。 5分组处理24小时后，流式细胞仪检测，分析凋亡细胞比例。 6分组处理24小时后，用ELIsA试剂盒检测细胞上清液中转化生长因子β1(TGFβ1)的表达情况。 结果： 体内实验 1各组大鼠的一般情况 小蓟饮子组、关木通+君药组、关木通+臣药组大鼠的一般情况，比单纯关木通组有明显改善。 2大鼠相关肾功能比较结果 小蓟饮子组、关木通+君药组、关木通+臣药组的血BUN、Scr与关木通组比较明显降低(P0.01)。 3大鼠肾组织切片在光镜和电镜下的观察结果 分别在光镜和电镜下观察各组大鼠肾组织切片，可见正常对照组的肾小球、肾小管及肾间质未见明显异常，其余各组有不同程度的损伤，但小蓟饮子组、关木通+君药组、关木通+臣药组的损伤程度明显小于关木通组、关木通+佐药组及关木通+使药组。 体外实验 1马兜铃酸Ⅰ(AAⅠ)的含量结果 采用高效液相色谱法检测关木通组、小蓟饮子组、关木通+君药组、关木通+臣药组的AAⅠ的含量分别为0.6034mg／ml，0.1 06 ***／ml，0.11 19mg／ml，0.1600mg／ml。 2 HK-2细胞体外培养结果 经传代培养后的HK-2细胞，一般24小时全部贴壁，纯度极高，生长迅速，很快融合成片，密集时可重叠生长，3-5天即可进行传代培养。细胞培养成功且符 合实验要求。 3 HK-2细胞形态学观察结果 在倒置显微镜下观察，正常对照组HK-2细胞为卵圆形或多边形贴壁细胞，细胞间连接紧密，成片生长。小蓟饮子组、关木通+君药组、关木通+臣药组可见细胞轮廓清晰，细胞折光度增强，细胞变小、变圆。关木通组可见到大多数细胞明显缩小变圆，与周围细胞脱离，细胞膜仍保持完整，但表面有“发泡现象，部分细胞漂浮于培养液中。 4 HK-2细胞凋亡比例结果 用流式细胞仪检测分析凋亡细胞比例发现小蓟饮子组、关木通+君药组、关木通+臣药组的HK-2细胞凋亡率低于单纯的关木通组(P0.05)。 5细胞上清液中TGFβ1的表达结果 用ELIsA试剂盒检测TGFβ1的表达情况发现小蓟饮子组、关木通+君药组、关木通+臣药组的细胞上清液中TGFβ1的分泌水平低于单纯关木通组(P0.01)。 结论： 本研究表明： 1小蓟饮子全方及小蓟饮子中的君药、臣药有减轻关木通肾毒性的作用;2小蓟饮子全方及小蓟饮子中的君药、臣药能减少关木通中马兜铃酸Ⅰ的含量;3小蓟饮子全方及小蓟饮子中的君药、臣药对关木通诱导HK-2细胞的凋亡及TGFβ1的分泌水平有一定的抑制作用。 小蓟饮子全方及小蓟饮子中君药、臣药除通过降低关木通中马兜铃酸Ⅰ的含量而达到减轻关木通肾毒性的作用外，本身也能通过抑制HK-2细胞的凋亡及TGFβ1的分泌水平而达到减毒的作用。