蛇床子素对CYP3A、CYP2C9和CYP2D6酶活性影响的研究

作     者：梅蕾蕾 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡晓

授予年度：2014年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：蛇床子素 CYP3A CYP2D6 CYP2C9 抑制作用 

摘      要：背景： 前期利用肝微粒体实验，研究证实了在人肝微粒体中CYP3A4是蛇床子素的主要代谢酶，且CYP2D6、CYP2C9也可能参与了其代谢。本课题通过人肝微粒体及大鼠体内代谢模型，探讨蛇床子素对参与其代谢的三种亚酶活性的影响。 目的： 本课题拟通过人肝微粒体体外代谢研究方法并结合大鼠体内实验，研究蛇床子素对参与其代谢的三种主要亚酶探针药咪达唑仑（MDZ）、右美沙芬（DM）、双氯芬酸（DIC）代谢的影响，以考察蛇床子素对这三种亚酶活性的影响，进一步充实蛇床子素的药理研究，为蛇床子素及含蛇床子中药的临床合理应用提供理论依据，同时也为开展简单香豆素类化合物对药物代谢酶作用的影响研究提供资料。 方法： 1.建立检测大鼠血浆和人肝微粒体中MDZ及人肝微粒体中DM和DIC的HPLC-UV方法。 2.通过对温孵时间、蛋白浓度、底物浓度三方面的考察建立DM、DIC和MDZ在人肝微粒体体外最佳反应条件。 3.研究在体外肝微粒中，蛇床子素对人肝微粒体CYP3A4、CYP2C9、CYP2D6亚酶活性的影响。 4.研究腹腔注射不同剂量蛇床子素，尾静脉注射相同剂量的MDZ后，蛇床子素对CYP3A介导的MDZ在大鼠体内药代动力学的影响。 结果： 1.建立了检测大鼠血浆和人肝微粒体中MDZ及人肝微粒体中DM和DIC的HPLC方法。 ***在人肝微粒体中37℃，120r/min的情况下进行孵育，在5-40min内，DM呈线性消除;40-80min消除速率减缓，80-160min几乎不再变化，故最佳孵育时间为80min;在0.1-0.5mg/ml范围内，DM的消除随蛋白浓度增加而加快，确定蛋白浓度为0.5mg/ml;在10-100μM浓度范围内，DM代谢速率随底物浓度增加变化最大，因此，确定的最佳反应条件为80min、0.5mg/ml、100μM。DIC在人肝微粒体中37℃，120r/min的情况下进行孵育，在6-96min内，DIC呈线性消除;故最佳孵育时间为96min;在0.1-0.4mg/ml范围内，DIC的消除随蛋白浓度增加而加快，确定蛋白浓度为0.4mg/ml;在10-80μM浓度范围内，DIC代谢速率随底物浓度增加变化最大，因此，确定的最佳反应条件为96min、0.4mg/ml、80μM。MDZ在人肝微粒体中37℃，120r/min的情况下进行孵育，在5-30min内，MDZ呈线性消除，故最佳孵育时间为30min;在0.01-0.3mg/ml范围内，MDZ的消除随蛋白浓度增加而加快，确定蛋白浓度为0.2mg/ml;在2.5-5μM浓度范围内，MDZ代谢速率随底物浓度增加变化最大，因此，确定的最佳反应条件的为30min、0.2mg/ml、5μM。 3.在体外人肝微粒体中，蛇床子素在浓度为5、10μM时对CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4的酶活性均无显著性差异(P0.05);蛇床子素浓度为20、40、80μM时，DM代谢量的均数分别降低了30.8％（P0.05）、34.7％（P0.01）、54.4％（P0.01），DIC代谢量的均数分别降低了17.7％（P0.05）、20.0％（P0.05）、51.7％（P0.01），而MDZ在蛇床子素浓度为20μM时的代谢量相比对照组仍无显著性差异，40、80μM时MDZ代谢量的均数分别降低了19.7％（P0.05）、61.2％（P0.01）。通过GraghpadPrisrn5.0软件计算得出蛇床子素对CYP2D6、CYP2C9、CYP3A抑制作用的IC50值分别为69.78μM、71.68μM、68.45μM。 4.四组MDZ主要药动学参数：对照组AUC(0-t)(256.502mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(300.76mg·L·min-1)、MRT(0-t）（46.579min）、MRT(0-∞)（72.193min）、t1/2z（52.869min）、CLz（0.014L·min-1·kg-1）、Vz（1.007L·kg-1）;低剂量组AUC(0-t)(325.742mg·L·min-1)、 AUC(0-∞)(384.122mg·L·min-1)、 MRT(0-t）（47.081min）、MRT(0-∞（)73.678min）、t1/2z（54.784min）、CLz（0.01L·min-1·kg-1）、Vz（0.82L·kg-1）;中剂量组AUC(0-t)(482.665mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(626.279mg·L·min-1)、MRT(0-t）（81.253min）、MRT(0-∞)（147.581min）、t1/2z（110.381min）、CLz （0.006L·min-1·kg-1）、 Vz （1.02L·kg-1）;高剂量组AUC(0-t)(1