木荷皂甙抗稻瘟病原作用方式的研究

作     者：易磊 

作者单位：江西农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：霍光华

授予年度：2013年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：木荷皂甙 细胞膜通透性 稻瘟病原菌 菌丝体 作用方式 

摘      要：江西农业大学生物科学与工程学院生物物质分离实验室从木荷(Schima superba)中提取到抗稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)活性物质--木荷活性皂甙组分。研究表明：木荷活性皂甙组分对稻瘟病菌有较强的抑制作用，有望开发成为生物源农药。为了查明其对稻瘟病菌的作用方式及其对病原的作用靶位，本论文主要研究了各皂甙组分对稻瘟病菌抑制活性、受药处理后病原菌丝的形态变化、原生质体形态的变化;随后在此基础上进行了一系列细胞生理指标的测定。以研究各皂甙组分对稻瘟病菌细胞壁、细胞膜的影响。主要研究结果内容如下： (1)采用96孔板法测定了各个皂甙组分对稻瘟病菌菌丝体的MIC和MBC，结果显示木荷活性各皂甙均表现出较强的抗稻瘟病菌活性，其中M2IGR5R3的MIC最小为6.25μg/mL，在12.5μg/mL时，已经可以杀死99.5%的原始接入稻瘟病菌。M2IGR5R1、M2IGR5R2、M2IGR5R4、M2IGR5的最低抑菌浓度分别为56.25、25、14.0625、12.50μg/mL;最小杀菌浓度分别为225、25、112.5、50μg/mL。各皂甙组分中M2IGR5R3抑菌活性最强，具有开发植物源农药的潜力。 (2)将各皂甙作用于稻瘟病菌丝体后，通过对细胞壁的染色观察，发现各皂甙组分对稻瘟病菌丝体细胞壁均具有一定影响，可导致稻瘟病菌菌丝断裂、互相缠绕、膨肿等现象，甚至细胞壁染色模糊，未见完整细胞壁。在此基础上进一步测定与真菌细胞壁合成有关的N-乙酰葡萄糖胺含量和几丁质酶活性，发现经木荷活性皂甙组分处理后的稻瘟病菌丝体培养液的N-乙酰葡萄糖胺含量和几丁质酶活性均有不同程度的升高：其中受药处理后菌丝体N-乙酰葡萄糖胺含量为同时间对照组的1.46.8倍，受药后菌丝体几丁质酶活性为同时间对照组1.4.1倍。经推测：木荷活性皂甙组分可能导致菌丝体内葡萄糖的渗漏或阻碍了菌丝体对葡萄糖的吸收，进而诱导了几丁质酶基因的表达，水解几丁质产生N-乙酰葡萄糖胺，导致细胞壁生长异常。 (3)为进一步研究皂甙对稻瘟病细胞膜的作用方式，使用溶壁酶脱去稻瘟病菌细胞壁，发现受药后原生质体变型、粘连、破裂;进一步测定经皂甙处理过的稻瘟病菌培养液的电导率、可溶性糖渗漏量和可溶性蛋白渗漏量;结果表明：原生质体变型、粘连、破裂;细胞内含物蛋白质、可溶性糖外泄，培养液电导率增高，细胞壁几丁质酶活性增强，引起几丁质组成成分N-乙酰葡萄糖胺脱落。其中有效浓度为90%的皂甙M2IGR5R2处理的菌丝体2h时可溶性蛋白渗漏量达到了452.0568μg/g，为对照组的12倍以上，细胞膜相对渗透率达到48.9795%，为同时间对照组的1.63倍以上，可溶性糖渗漏量为同时间对照组的4.42倍以上。 综合分析，我们推测木荷皂甙对稻瘟病原菌的作用不仅仅是作用于细胞膜上，而且还进入到细胞内，促进液泡等细胞器释放出如几丁质水解酶等，引起细胞壁的瓦解。也有可能直接与核遗传物质DNA发生作用，触动了几丁质酶相关基酶的板机，产生几丁质酶，促使几丁质的降解，进一步加速稻瘟病原菌丝细胞的凋亡，从而起到杀菌作用。