绿茶提取物EGCG对人肝癌细胞株HepG2裸鼠移植瘤作用及其机制探讨

作     者：秦姣 

作者单位：泸州医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：龙汉安

授予年度：2010年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：EGCG 原发性肝癌 移植瘤 HIF-1α VEGF MVD 新生血管生成 超微结构 

摘      要：目的：通过瘤体接种BALB/C (n/n)裸鼠,复制人肝癌细胞株HepG2裸鼠皮下移植瘤模型,观察绿茶提取物EGCG干预对HepG2移植瘤组织结构、超微结构及新生血管生成的影响,并探讨其可能的作用机制。拟为绿茶提取物EGCG应用于临床肝癌治疗积累实验依据,以期为肝癌治疗提供新思路和新方法。方法：1.体外复苏、培养人肝癌HepG2细胞,常规收集对数生长期细胞、调整成细胞密度为1.5×107/ml的细胞悬液,以每鼠0.2ml接种于4只裸鼠腋窝皮下。待皮下成瘤至长径约8mm时,处死裸鼠、剥离瘤体,取离体瘤组织以2mm X 2mm X 2mm大小分别接种于20只裸鼠腋窝皮下。待接种瘤体长至长径约6mm,将荷瘤裸鼠随机分为实验组与对照组,每组10只。实验组裸鼠每天腹腔注射EGCG标准品溶液20mg/kg只,对照组裸鼠以相同方式给予等量灭菌注射用水处理。干预3周后处死裸鼠,完整剥离移植瘤测量长、短径,计算瘤体积并称重,按公式IR=(1—实验组瘤重／对照组瘤重)×100%计算抑瘤率,取裸鼠心、肝、脾、肺及肾组织固定备用。***染色光镜观察实验组与对照组HepG2移植瘤及裸鼠重要脏器组织结构。3.透射电镜观察实验组与对照组HepG2移植瘤超微结构。***-PCR检测实验组与对照组HepG2移植瘤HIF-1α、VEGF mRNA表达。5.免疫组织化学法检测实验组与对照组HepG2移植瘤HIF-1α、VEGF蛋白表达,并通过检测CD34表达计数瘤组织微血管密度(MVD)。6.所有实验结果用SPSS16.0软件进行统计分析,以P0.05作为差异有统计学意义。 结果：1.实验组HepG2移植瘤体积、重量均明显小于对照组(P0.05),抑瘤率达31.63%±4.09%。2.光镜观察,实验组HepG2移植瘤见大量均质红染无结构区伴周边炎细胞浸润,瘤体内血管数量稀少或缺如;对照组见瘤细胞呈巢团状分布,细胞异型性明显,血管增生活跃。实验组裸鼠心、肝、脾、肺、肾组织结构未见明显病理改变,与对照组裸鼠脏器组织结构比较无明显差异。3.透射电镜观察,实验组HepG2移植瘤组织见不同时期凋亡细胞,部分形成凋亡小体,还可见坏死瘤细胞及崩解细胞碎片;对照组呈现细胞形态怪异,核大畸形、电子密度不均,多核仁或核仁肥大,常染色质明显,线粒体丰富等恶性肿瘤特有的超微结构特点。***-PCR结果显示,实验组HepG2移植瘤HIF-1α、VEGF mRNA表达水平相对于对照组均明显下调(P0.05)。5.免疫组化结果表明,实验组HepG2移植瘤中HIF-1α、VEGF蛋白表达水平比对照组明显下调(P0.05),结果与RT-PCR一致;实验组MVD比对照组明显下降(P0.05)。结论：1.绿茶提取物EGCG对人肝癌细胞株HepG2裸鼠皮下移植瘤具有生长抑制作用。***干预使HepG2移植瘤血管数量明显减少,MVD下降,提示EGCG可抑制HepG2移植瘤新生血管生成。3.对比实验组与对照组HepG2移植瘤超微结构特点,推测EGCG可能诱导HepG2移植瘤细胞凋亡。4.根据RT-PCR及免疫组化结果,推测下调HIF-1α和VEGF表达,进而抑制HepG2移植瘤新生血管生成,是EGCG抗肝癌作用机制之一。***干预期间,HepG2荷瘤裸鼠重要脏器未见明显病理改变。