细胞内吞作用基因MoARK1和MoPAN1在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的功能研究
作者单位：南京农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：张正光
授予年度：2012年
学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治]
摘 要：稻瘟病是水稻生产上一种毁灭性真菌病害,该病害严重限制和威胁全球的水稻生产。目前,人们广泛地选育抗病品种防治此病,但由于该病原菌的致病性易变,新的致病小种的产生容易导致新选育的抗病品种失去利用价值。因此,稻瘟病的防治始终是水稻生产上的一个重要难题。控制该病害的重要前提是了解该病原真菌(Magnaporthe oryzae)生长发育及致病分子调控机制。随着稻瘟病菌全基因组序列的公布及遗传转化操作系统的建立,其致病相关基因功能的发掘也随之加快,这就为寻找新的稻瘟病菌杀菌剂作用靶标,设计新的稻瘟病控制策略提供理论依据。 细胞内吞(cell endocytosis)是普遍存在于酵母及哺乳动物中的一个复杂的质膜运输过程,其包括各种蛋白质及脂质激酶,磷酸(酯)酶、信号分子的吸收和肌动蛋白骨架的排列。在此过程中,质膜蛋白、脂质及一些大分子物质通过胞内的囊泡运输被分配到早期的内涵体中,随之在成熟的内涵体及液泡中降解,或者作为一种蛋白受体循环到质膜中被重新利用。 在酵母细胞中,内吞作用发生的早期,蛋白Edelp和网格蛋白最早结合到细胞膜上参与细胞内吞作用的初始。此外,Sla2p可以被循环利用,同时也可以与Slalp相互作用,从而激活复合结构Slalp-Panlp-End3p以进行一系列蛋白的相互作用。因此,内吞作用是一个连贯的过程,不仅存在各种物质的循环利用,而且可逆的磷酸化也是必不可少的过程。在众多的激酶家族中,Ark/Prk激酶家族是这一过程的重要调节激酶。虽然丝状真菌中的细胞内吞过程还没有较完整的阐释,但是研究表明在丝状菌丝的顶端确实存在内吞作用。在稻瘟病菌中,已报道的△MoSec22和△MoVam.7的缺失突变体均不同程度影响了内吞过程的发生。鉴于此研究基础,为了进一步了解该菌中细胞内吞作用的发生过程,选取其中的Ark1及Pan1为研究对象。 本文根据同源序列比对,在稻瘟病菌基因组数据库中搜索到一个与酵母ARK1同源的基因,命名为MoARK1.序列分析表明该基因编码的蛋白含有1020个氨基酸,在N端含有一个磷酸激酶结构域,在其C端存在三个磷酸化位点及一个富含脯氨酸结构域。根据同源重组原理,采用原生质体转化方法获得了其敲除突变体AMoark1。生物学性状分析发现,MoARKl缺失突变体对不同胁迫因子表现出低敏感性,产孢量降低,膨压降低导致不能成功侵入寄主导致致病性降低;更重要的是MoARKl参与菌丝细胞壁完整性,顶体形成及细胞内吞作用的调控。此外,MoArkl定位于菌丝顶端类似于actin蛋白,并且SNAREs蛋白家族中的MoSec22和MoVam7共同参与到MoARKl的亚细胞定位。 本文同时在稻瘟病菌中发现另一个参与内吞过程的酵母Panlp的同源基因MoPANl,该基因编码的蛋白含有1462个氨基酸,在其N端含有两个EH(Eps15Homology)功能域。MoPAN1的沉默导致突变体改变对不同胁迫因子的敏感性,影响其细胞壁完整性,产孢量降低,不能产生膨压导致致病性丧失;更重要的是突变体丧失细胞内吞作用。上述结果表明：MoPAN1作为一个调节中心参与到细胞内吞过程,在致病性、细胞壁完整性应答及细胞内吞作用等方面,具有重要调控作用。
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