小麦粒重基因TaGW2的克隆、原核表达及分子标记的开发

作     者：杨子博 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李学军

授予年度：2012年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：小麦 TaGW2 基因 原核表达 AS-PCR 标记 

摘      要：小麦是我国主要的粮食作物，其产量的提高对全国乃至世界范围内的粮食安全具有重要意义。而传统育种方法提高小麦产量的幅度有限，从产量形成要素的分子方面进行改良以大幅度提高小麦产量逐渐成为育种家研究的重点。粒重是产量形成要素的重要方面，对小麦粒重性状的研究主要集中在对其QTL的挖掘上，而对其主效QTL的分离还鲜有报道。本研究以中国春、兰考大粒为材料，利用水稻GW2基因以及其它近缘物种的同源基因，结合小麦的EST序列，设计特异引物进行基因克隆及功能验证，取得如下研究结果： 1.获得了小麦中TaGW2基因编码区的三个同源cDNA序列，其中每一序列全长1275bp,编码424个氨基酸,在61～103位氨基酸处为一RING结构域，该结构域使TaGW2基因具有泛素连接酶的活性。序列比对发现三个序列之间的差异不大。通过对中国春和兰考大粒之间各序列比对分析，发现兰考大粒中一个TaGW2基因序列的第8外显子977bp处有一T碱基的插入，导致序列编码框发生改变，在984bp处提前出现终止子TAG，最终编码328个氨基酸。 2.构建了兰考大粒中突变TaGW2基因及中国春该基因的原核表达载体pET32a-TaGW2-LK和pET32a-TaGW2-CS，并在大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测表达产物。其中兰考大粒突变的TaGW2等位基因表达了37.1KD大小的蛋白，而中国春TaGW2基因表达的蛋白大小为47.3KD,这与我们所预测的结果一致,进一步确定了兰考大粒中TaGW2基因突变位点的存在。 3.针对兰考大粒中TaGW2基因的突变位点，设计了4组AS-PCR标记，并在两个品种中筛选出多态性好的3组标记。用其中一组标记以及第六套中国春缺体-四体系将突变的TaGW2基因定位到小麦6A染色体上。 4.以兰考大粒与中国春为亲本构建F2群体327个单株，用所开发的标记分析各单株的基因型，其中有TT基因型75株，Tt基因型184株，tt基因型68株。构建F2:3群体327个株系，调查三个环境下籽粒的产量性状。基因型与表型的关联分析显示，T插入突变与籽粒的表型相关，能够显著增加粒宽和粒重，其中TT基因型籽粒比tt基因型籽粒宽0.18mm，千粒重高3.94g。 5.利用所开发的标记在另外22个小麦品种中又检测到两个含有突变TaGW2基因的品种，四川大粒和皖麦38，这两个品种都表现出较大的籽粒。对这两个品种的TaGW2基因进行克隆测序，测序结果与标记分析结果一致。 本研究结果表明TaGW2基因负调控小麦籽粒的发育，其可能与水稻GW2基因有相同的作用机制。所开发的标记稳定可靠，能够用于小麦分子标记辅助育种中，为小麦的高产分子育种提供有效的选择工具。