中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNA编码的βC1蛋白的磷酸化对其抑制转录水平基因沉默的影响

作     者：曹琳鸽 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周雪平

授予年度：2015年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：中国番茄黄化曲叶病毒 βC1 磷酸化 甲基化 TGS 

摘      要：中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)是单组份的双生病毒,其伴随的卫星DNA (Tomato yellow leaf curl China Betasatellite, TYLCCNB)编码的pC1蛋白是一个致病因子和RNA沉默抑制子,不仅能够诱导严重的病毒症状而且能够抑制甲基化介导的转录水平基因沉默(Transcriptional gene silencing, TGS)。为了抵御双生病毒的侵染,番茄中具有激酶活性的SlSnRK1[Snf (sucrose non-fermenting)-1-related protein kinasesl]蛋白可以通过磷酸化βC1从而减轻病毒诱导的症状。但是,目前尚不清楚pCl的磷酸化如何进一步影响其相关功能。因此,本文围绕pCl蛋白的磷酸化修饰对其抑制TGS能力的影响开展了相关研究。 前期的研究表明,将pCl蛋白两个潜在的磷酸化位点—第33位的丝氨酸(Serine, Ser)和78位的苏氨酸(Threonine, Thr),分别或者同时突变为组成型磷酸化的天冬氨酸(Aspartic acid, Asp),突变体的侵染性克隆在本氏烟上的发病时间延迟,侵染效率下降;而将Ser33和Thr7s分别或者同时突变为不能被磷酸化的丙氨酸(Alanine, Ala)后,突变体侵染性克隆在本氏烟上的发病时间和侵染效率与野生型pC1的侵染性克隆相似。 为了明确pCl磷酸化是否影响pC1蛋白的表达水平,首先将构建于马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)表达载体上的6个βCl磷酸化突变体pGR106-βC1S33A, pGR106-βC1S33D、pGR106-βC1T78A、pGR106-βC1T78D、pGR106-βC1S33A/T78A和pGR106-βC1S33D/T78D分别接种本氏烟,以pC1的单克隆抗体进行Western blot分析,发现βC1突变后其蛋白表达量无明显差异。进一步将PVX相关重组载体接种GFP转录水平沉默的16-TGS本氏烟,发现pCl的非组成型磷酸化突变体pGR106-βC1S33A、pGR106-βC1T78A和pGR106-βC1S33A/T78A与野生型PGR106-βC1一样可以回复GFP荧光,但是其组成型磷酸化的突变体PGR106-βC1S33D、pGR106-βC1T78D和pGR106-βC1S33D/T78D不能回复GFP荧光,表明pC1的组成型磷酸化突变体不能抑制GFP的转录水平基因沉默。 利用Chop-PCR实验发现,pC1非组成型磷酸化突变体侵染性克隆TYLCCNBS33A、 TYLCCNBT78A和TYLCCNBS33A/T78A与野生型TYLCCNB一样可以降低其辅助病毒TYLCCNV基因组的甲基化水平,但是pCl组成型磷酸化突变体的侵染性克隆TYLCCNBS33D、TYLCCNBT78D和TYLCCNBS33D/T78D不能降低辅助病毒TYLCCNV基因组的甲基化水平,表明pC1的组成型磷酸化突变体减弱了其抑制辅助病毒TYLCCNV基因组甲基化的能力。 以上结果表明,pC1蛋白的组成型磷酸化突变体可能通过减弱其抑制辅助病毒甲基化的能力,从而失去了抑制甲基化介导的TGS的能力。