烟曲霉菌性角膜炎中LOX-1和TLR4相互作用调节ROS生成的研究

作     者：高欣然 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵桂秋

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

主      题：烟曲霉菌 角膜炎 LOX-1 TLR4 ROS 

摘      要：目的:为了探讨烟曲霉菌性角膜炎中LOX-1和TLR4的关系,证明在烟曲霉菌性角膜炎中LOX-1和TLR4可以相互作用,并且通过调节活性氧(ROS)的产生调节炎症。方法:用具有活性的烟曲霉菌菌丝感染C57BL/6小鼠角膜,制作小鼠烟曲霉菌性角膜炎模型,用灭活的烟曲霉菌菌丝刺激从C57BL/6小鼠腹腔提取的中性粒细胞。采用LOX-1中和抗体、Poly(I)(LOX-1抑制剂)及CLI-095(TLR4抑制剂)预处理C57BL/6小鼠角膜后再用有活性的烟曲霉菌菌丝感染。采用real-time RT-PCR、western blot方法检测正常和烟曲霉菌感染角膜中的LOX-1、TLR4和IL-1β的mRNA和蛋白水平的表达,以及检测正常和烟曲霉菌菌丝刺激的中性粒细胞中的LOX-1、TLR4和IL-1β的mRNA表达。采用流式细胞术检测从C57BL/6小鼠腹腔提取的中性粒细胞中ROS的产生情况,观察烟曲霉菌菌丝刺激中性粒细胞后ROS的生成变化。用LOX-1中和抗体、Poly(I)(LOX-1抑制剂)及CLI-095(TLR4抑制剂)预处理从C57BL/6小鼠腹腔提取的中性粒细胞后再用灭活的烟曲霉菌菌丝刺激,再采用流式细胞术检测预处理后中性粒细胞中ROS的生成变化。结果:烟曲霉菌菌丝感染C57BL/6小鼠角膜后LOX-1、TLR4和IL-1β的mRNA和蛋白表达水平增高。当采用LOX-1中和抗体预处理C57BL/6小鼠角膜阻断LOX-1后,再用烟曲霉菌菌丝感染,TLR4和IL-1β的mRNA表达水平都降低。为进一步验证,采用LOX-1抑制剂Poly(I)预处理C57BL/6小鼠角膜阻断LOX-1后,再用烟曲霉菌菌丝感染,TLR4和IL-1β的mRNA表达水平也都降低。进一步检测蛋白水平发现,采用LOX-1中和抗体和LOX-1抑制剂Poly(I)预处理C57BL/6小鼠角膜阻断LOX-1后,再用烟曲霉菌菌丝感染,TLR4和IL-1β的蛋白表达水平都降低。当采用CLI-095预处理C57BL/6小鼠角膜阻断TLR4后,再用烟曲霉菌菌丝感染时,LOX-1和IL-1β的mRNA表达水平都降低。进一步检测蛋白水平发现,采用CLI-095预处理C57BL/6小鼠角膜阻断TLR4后,再用烟曲霉菌菌丝感染时,LOX-1和IL-1β的蛋白表达水平也都降低。与正常组相比,灭活的烟曲霉菌菌丝刺激C57BL/6小鼠腹腔提取的中性粒细胞后,LOX-1、TLR4和IL-1β的mRNA表达水平升高,并且在烟曲霉菌刺激后8小时达到高峰,随后表达降低。流式细胞术检测结果显示:与正常组相比,灭活的烟曲霉菌菌丝刺激C57BL/6小鼠腹腔提取的中性粒细胞后,ROS产生增多。采用LOX-1中和抗体、Poly(I)预处理C57BL/6小鼠腹腔中性粒细胞阻断LOX-1后,再用灭活的烟曲霉菌菌丝刺激时,ROS的产生减少。采用CLI-095预处理C57BL/6小鼠中性粒细胞阻断TLR4后,再用灭活的烟曲霉菌菌丝刺激时,ROS的产生减少。结论:C57BL/6小鼠烟曲霉菌性角膜炎中LOX-1、TLR4和IL-1β的表达升高。抑制LOX-1可以降低TLR4和IL-1β的表达,抑制TLR4可以降低LOX-1和IL-1β的表达,说明烟曲霉菌感染C57BL/6小鼠角膜的过程中,LOX-1和TLR4可以相互作用,促进炎症。烟曲霉菌感染后中性粒细胞中ROS的产生增多,抑制LOX-1或抑制TLR4都可以减少ROS的生成。在烟曲霉菌性角膜炎中LOX-1和TLR4可以相互作用并且可以通过调节ROS的产生来调节炎症。