血清中骨质疏松相关蛋白分子标志物的筛选研究

作     者：赵卓杰 

作者单位：第四军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：罗卓荆;杨柳

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：大鼠去势骨质疏松模型 蛋白芯片 早期诊断 b-NGF B7-2 Elisa试剂盒 Fractalkine IFNg MCP-1 TIMP-1 

摘      要：背景:骨质疏松(osteoporosis,OP)是因全身骨质量减少、骨组织的微结构劣化和骨组织强度降低而发生的骨代谢性疾病[1]。骨质疏松可分为原发性、继发性及特发性三类:原发性骨质疏松是指非其他因素导致的骨质疏松,绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松是原发性骨质疏松的主要类型;继发性骨质疏松则是指由任何影响骨代谢的疾病、药物或器官移植等引起的骨质疏松。特发性骨质疏松主要指青少年发生的骨质疏松。此外,按发生部位亦可分为局限性或泛发性骨质疏松。骨质疏松发病率位于骨科常见病之首[2],我国是骨质疏松患者最多的国家,并且随着人均预期寿命的延长,其发病率将不断上升[3]。骨质疏松不仅是受到世界密切关注的突出公共卫生问题,其昂贵的检测及治疗费用也带给社会及家庭沉重的经济负担。因此,加深对骨质疏松发病机理的认识,寻找影响其发病的关键因子,探索可能的早期干预靶点和干预方式,将成为骨质疏松的研究热点。双能X线骨吸收测量仪(DXA)测定骨密度是目前临床诊断骨质疏松的金标准[4],临床上以骨密度(BMD)T Score﹤-2.5为诊断标准(T Score是以峰值骨密度为参考的标准化值,即以相应种族、性别的正常年轻人群作为参考的标准值)[5]。但此方法存在仪器携带困难、检测费用高昂等缺点,因此寻找便捷、经济的骨质疏松检测方法成为目前研究的热点。近年来随着蛋白组学技术的发展,大规模、高通量检测技术的逐渐成熟,环磷酰胺(CTX)和I型胶原氨基端前肽(PINP)等可作为骨形成和骨吸收特异性标记物的蛋白因子陆续被发现[6]。但目前仍缺乏较理想的骨质疏松早期临床诊断的特异性检测指标。因此,本研究的目的是采用蛋白组学技术筛选骨质疏松症发病早期血清中含量发生显著性变化的蛋白标志物,为便捷、经济的诊断早期骨质疏松症提供新的可能。实验一:大鼠血清中骨质疏松相关蛋白分子标志物的筛选研究目的:通过对骨质疏松可能的分子标记物的筛查,寻找出大鼠血清中对骨质疏松更早期、更敏感、更特异的新型分子标记物,为下一步临床验证早期骨质疏松提供目标。方法:1)大鼠骨质疏松模型制作。20只成年健康雌性sd大鼠随机分为ovx组和sham组,每组10只。ovx组:根据体重,使用戊巴比妥钠40mg/kg用腹腔内注射方式对大鼠进行麻醉;而后对大鼠进行备皮及消毒处理;在双侧肋下1cm腹背处与脊柱双侧约1.5cm的皮肤交界处纵向切开约1cm切口,分离皮下及肌肉组织,寻找各侧大鼠卵巢,找到后结扎并切除卵巢;而后分别缝合腹膜、肌肉及皮肤。缝合结束对切口进行消毒;最后将大鼠放回鼠笼待其苏醒。大鼠术后每日注射青霉素40wu、连续3日,预防感染。sham组:两侧卵巢不切除、仅切除两侧卵巢四周同等大小的脂肪组织,其余处理方式与ovx组相同。2)血清样本提取:对ovx组和sham组各大鼠于术后2、4、6、8周采用内眦静脉取血法取血1.5ml存于ep管中,静置4小时后离心,提取血清,保存于-80℃冰箱备用。3)显微ct检测:卵巢切除术后2、4、6、8周利用显微ct扫描两组活体大鼠股骨。扫描结束后,利用软件进行骨小梁的三维重建及相关结构参数的计算。4)蛋白芯片检测:按照说明书提供的方法梯度稀释标准品;对芯片进行操作。最后,利用荧光扫描仪获取信号,分析数据。结果:1)ovx组各大鼠骨密度从第4周开始逐渐减少,到第8周大鼠骨密度明显降低;而sham组大鼠骨密度从假卵巢切除术后开始至术后第8周未见明显变化。2)ovx组大鼠松质骨形态计量学静态参数bv/tv、***及tb.n均从第4周开始下降,到第8周bv/tv、***及tb.n下降显著;***从第4周开始上升,到第8周***上升明显。而sham组大鼠松质骨形态计量学静态参数均未见明显变化。3)b7-2、b-ngf、fractalkine、ifng、mcp-1、timp-1六个因子从卵巢去势术后第4周开始上升,至第8周这六个因子上升显著;而在sham组大鼠血清上述蛋白因子均未见明显变化。结论:大鼠骨质疏松模型建立成功;骨质疏松模型大鼠血清中包括b7-2、fractalkine、timp-1、mcp-1、b-ngf、ifng在内的6个蛋白标志物存在特异性。实验二:人体血清中骨质疏松相关新型生化标志物的验证目的:进一步验证骨质疏松患者、骨密度降低人群及骨密度正常人群血清中fractalkine、timp-1、mcp-1三个蛋白因子是否存在差异,在人体中寻找出能够早期反映骨质疏松发生、发展的特异性因子,为下一步应用于临床诊断早期骨质疏松提供目标。方法:1)临床上利用负压抽血器收集骨质疏松患者、骨密度降低人群及骨密度正常人群的血液2ml置于离心管内,将所采集的血液采用3000rpm/min离心10min;离心结束后汲取样本上清液存于2mlep管中,最后将采集好的血清样本保存