利用“3i”体系分离培养小鼠和山羊胚胎干细胞

作     者：刘晓坤 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马保华

授予年度：2014年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 090501[农学-动物遗传育种与繁殖] 

主      题：胚胎干细胞 “3i”培养体系 小鼠 山羊 

摘      要：胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）具有维持自我更新和多能性的能力，但在传统的有饲养层和血清的干细胞分离培养体系中很难建立昆白小鼠的ESCs系和山羊的ESCs系。有研究证明，应用添加三种小分子化合物（MEK inhibitor，ALK5inhibitor和GSK3β inhibitor）组成的“3i培养体系能抑制诱发分化的信号通路，从而更有利于分离并维持ESCs传代培养。利用此方法，一些很难分离ESCs的物种成功分离了具有形成嵌合胚胎能力的ESCs。本研究目的在于利用“3i体系分离培养昆白系小鼠和山羊的ESCs，研究工作取得以下结果： （1）在无饲养层、无血清的培养体系中添加2.5μM6-溴靛玉红-3-肟（6-bromoindirubin-3’-oxime，BIO）（GSK3β信号通路抑制剂），分离得到了2株来源于昆白小鼠体外受精囊胚的ESCs系。在这个培养体系中，体外受精来源的扩张囊胚可以自发孵化并贴壁。培养过程中，可以观察到类胚胎干细胞集落，经过扩增，得到了2株昆白小鼠ESCs系，分别命名为KMES1和KMES2。这2株细胞系和其他啮齿类动物的ESCs具有相同的形态学特征，具有碱性磷酸酶活性，具有与细胞多能性相关的细胞标记，包括Oct-4, Nanog和SSEA-1。拟胚体实验和畸胎瘤实验证明分离得到的ESCs可以在体内外自发分化为三胚层来源的细胞。 （2）对关中奶山羊进行超数排卵和配种，手术法采集体内发育囊胚。在添加有2.5μM BIO、0.5μM PD184352（MEK信号通路抑制剂）、0.5μM SB431542（ALK5抑制剂）和1000U/mL白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）的“3i体系中分离培养ESCs。共超排了118只关中奶山羊，获得1204枚囊胚，分析表明，季节和气温变化会影响关中奶山羊的超排效果，秋冬季超排处理期间气温骤降会显著降低超排羊的胚胎回收数。通过机械分割法将超排获得的囊胚内细胞团分离后接种于铺有饲养层细胞的四孔板，在“3i培养体系中培养，分离得到了山羊类ESCs，并传至12代，类ESCs具有碱性磷酸酶活性、表达OCT-4和Nanog，经悬浮培养可形成拟胚体，拟胚体贴壁培养后可自发分化为神经样细胞。 研究结果证明，添加有BIO培养体系可以支持无饲养层、无血清条件下小鼠ESCs的建系;在添加有BIO，SB431542和PD184352三种小分子化合物的培养体系中，可以分离得到山羊类ESCs，这为加快良种山羊的育种速度提供重要的技术平台。