Pantoea dispersa蔗糖异构酶的重组表达及应用研究

作     者：刘军彤 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈晟

授予年度：2016年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081703[工学-生物化工] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：蔗糖异构酶 异麦芽酮糖 大肠杆菌 短小芽孢杆菌 发酵优化 

摘      要：蔗糖异构酶(EC 5.***.99.11),能够将底物蔗糖转化成其同分异构体异麦芽酮糖和海藻酮糖。已报道的大部分蔗糖异构酶酶反应的主产物为异麦芽酮糖。由于异麦芽酮糖具有甜度较高、易溶于水、预防糖尿病及不致龃齿等性质,因此适用于儿童及糖尿病患者等,能应用于糖果、糕点等食品领域。本研究将来源于Pantoea dispersa UQ68J的蔗糖异构酶基因在Escherichia coli和Bacillus brevis中重组表达,优化培养条件提高蔗糖异构酶的表达量。此外,本实验对蔗糖异构酶粗酶液进行分离纯化,并研究了蔗糖异构酶的相关酶学性质及应用特性。主要研究内容如下。(1)将*** UQ68J来源的蔗糖异构酶基因(含信号肽及成熟蛋白)进行密码子优化后,与无信号肽的表达载体pET-24a(+)连接。将构建正确质粒转入*** BL21(DE3)构建表达菌株—ORI菌株。采用TB培养基发酵培养,胞外酶活及总酶活分别达到65、85 U·mL-1。为提高蔗糖异构酶产量,研究了PelB、Omp A信号肽及不同的成熟蛋白起始位点对蔗糖异构酶的影响,发现从天然信号肽开始第22位氨基酸作为成熟蛋白的起始,连接PelB信号肽构建的P22菌株总酶活最高,达到143 U·mL-1,是ORI菌株总酶活的1.5倍;同时其发酵上清与周质空间中蔗糖异构酶酶活之和是ORI菌株相应酶活的1.3倍。由于P22菌株发酵时,其周质空间及细胞浆内分布大量蔗糖异构酶,为进一步提高蔗糖异构酶的胞外产量,3 L发酵罐中,研究甘氨酸浓度和诱导时间对蔗糖异构酶酶活的影响。当补加0.5%甘氨酸,DCW为18 g·L-1开始诱导,P22菌株的蔗糖异构酶胞外酶活最高达1981 U·mL-1,同时总酶活达到2640 U·m L-1。(2)将去除信号肽序列的蔗糖异构酶基因(起始位点为第22或34位氨基酸)与Bacillus brevis胞外表达载体pSVEB连接,构建的重组表达载体转入宿主***中,构建重组菌株B22、B34菌株。摇瓶中,经TM培养基发酵培养48 h,B22菌株胞外酶活达到50U·m L-1,B34菌株胞外酶活为35 U·m L-1。对B22菌株进行摇瓶培养基优化,蔗糖异构酶胞外酶活达到138 U·m L-1。为进一步提高蔗糖异构酶产量,在3 L发酵罐中研究了氮源含量及搅拌恒转速对蔗糖异构酶的影响。当氮源含量为30 g·L-1,恒转速为400 r·min-1时,蔗糖异构酶的胞外酶活提升至190 U·m L-1。(3)将不同宿主菌表达的胞外蔗糖异构酶经分离纯化后,研究相关酶学性质。大肠杆菌和短小芽孢杆菌表达的胞外蔗糖异构酶,两者最适温度及pH都是30℃和6.0。而且,两者比活分别是597.0、555.0 U·mg-1。此外,对动力学进行研究:大肠杆菌及短小芽孢杆菌表达的蔗糖异构酶Vmax分别为660.9、657.2 U·mg-1;Km分别为21.3、20.6 m M;Kcat分别为730、724 s-1及Kcat/Km分别是34.3、35.1 mM-1·s-1。(4)研究了不同条件对蔗糖异构酶催化蔗糖形成异麦芽酮糖的影响,获得最优的酶转化条件为,加酶量20 U·g-1,初始pH 6.5,35℃及底物浓度为400 g·L-1,转化率最高达到92.0%;同时,底物浓度提升至700 g·L-1,转化率仍然高于90%。