蛋白激酶Cβ2在不同血糖模式致人内皮细胞损伤中的作用

作     者：林雪波 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周波

授予年度：2010年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：蛋白激酶Cβ2 过氧化物酶体增殖物激活受体α 人脐静脉内皮细胞 高糖 糖尿病视网膜病变 蛋白激酶Cβ2 活性氧 人脐静脉内皮细胞 血糖 高糖记忆 蛋白激酶Cβ2 血糖波动 人脐静脉内皮细胞 二甲双胍 

摘      要：目的研究蛋白激酶C(PKC)β2、PPARα在高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)mRNA中的作用及相互关系。 方法将培养的HUVECs分为以下8组:正常糖(NG,5 mmol/L D-葡萄糖)组、高糖(HG,25 mmol/L D-葡萄糖)组、渗透压对照组(L,NG + 20 mmol/L L-葡萄糖)组、正常糖空载体转染(NN,NG + Ad5-null)组、高糖PKCβ2转染(HB,HG+Ad5-PKCβ2)组、高糖+非诺贝特组(HF,HG + 40μmol/L非诺贝特)组、高糖PKCβ2转染+非诺贝特(HBF,HB + 40μmol/L非诺贝特)组,以上各组细胞均培养6天。另高糖孵育细胞6天后再与非诺贝特共培养20min作为HF20组。以RT-PCR检测VEGF、VCAM-1 mRNA的表达水平,用Western印迹法测定PPARα蛋白表达,采用激光共聚焦检测PKCβ2蛋白的表达和转位。 结果(1)HG组VEGF、VCAM-1 mRNA表达增加,分别为NG组的1.91倍和1.56倍(P值均0.05);HG诱导PKCβ2核转位激活,定量分析示HG组胞浆/胞核荧光强度比值较NG组降低37%(P0.05);HB组PKCβ2核转位与HG组相比更加明显,VEGF、VCAM-1 mRNA表达亦进一步增加,分别为NG组的2.59倍和2.07倍(P值均0.05)。(2)HG组PPARα蛋白表达较NG组减少了20%(P 0.05);与HG组相比,HF组PPARα蛋白水平上调了13%,VEGF、VCAM-1 mRNA表达则明显下调,分别为HG组的68%和74%(P值均0.05);与HG组相比,HF20组VEGF、VCAM-1 mRNA表达差异无统计学意义。(3)HB组PPARα蛋白水平进一步下降,为HG组的78%(P 0.05)。 结论高糖通过诱导HUVECs PKCβ2核转位激活,进而调控PPARα表达,增加VEGF、VCAM-1 mRNA的表达。 第二部分蛋白激酶Cβ2-活性氧交互环介导高糖致人内皮细胞损伤记忆效应 目的以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为体外模拟高血糖记忆的研究对象,观察蛋白激酶C(PKC)β2、活性氧(ROS)对其表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)mRNA的影响,并探讨PKCβ2、ROS在其中可能的交互作用。 方法将培养的HUVECs分为以下5组:正常糖(NG,5 mmol/L D-葡萄糖×3周)组、高糖(HG,25 mmol/L D-葡萄糖×3周)组、记忆(M,25 mmol/L D-葡萄糖×2周+5 mmol/L D-葡萄糖×1周)组、记忆PKCβ2转染(MB,25 mmol/L D-葡萄糖×2周+5 mmol/L D-葡萄糖×1周+ Ad5-PKCβ2)组、记忆+α-硫辛酸(MA,25 mmol/L D-葡萄糖×2周+5 mmol/L D-葡萄糖×1周+62.5μmol/Lα-硫辛酸)组。以RT-PCR法检测VEGF、VCAM-1 mRNA表达水平,用荧光显微镜和荧光酶标仪测定ROS水平,采用激光共聚焦检测PKCβ2蛋白的表达和转位。 结果(1)HG组和M组VEGF、VCAM-1 mRNA表达增加,分别为NG组的1.76倍、1.35倍和1.69倍、1.43倍(P值均0.05)。(2)HG组和M组ROS水平分别较NG组升高了86%、80% (P值均0.05);MA组ROS水平较M组下降了38%,同时MA组VEGF、VCAM-1mRNA表达亦较M组显著下调,分别为M组的67%、78%(P值均0.05)。(3)HG组和M组PKCβ2核转位激活,定量分析显示,胞浆/胞核荧光强度比值均较NG组下降,分别为NG组的70%、74%( P值均0.05);MB组PKCβ2核转位较M组更为明显,胞浆/胞核荧光强度比值为M组的77%,同时MB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达亦较M组进一步上调,分别为M组的1.29倍、1.18倍(P值均0.05)。(4)MA组PKCβ2核转位较M组减少,胞浆/胞核荧光强度比值为M组的1.18倍;而MB组ROS水平较M组上调了25%(P值均0.05)。 结论HUVECs存在高糖记忆效应,PKCβ2-ROS交互环可能介导了这个效应的发生。 第三部分高糖波动激活蛋白激酶Cβ2损伤人内皮细胞及二甲双胍的干预作用 目的观察波动性高糖与持续性高糖对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)mRNA表达及活性氧(ROS)水平的