与新的抗辐射相关蛋白AA12及CHK1相互作用蛋白的筛选

作     者：薛恒钢 

作者单位：第三军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周红

授予年度：2004年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：CHK1 AA12 酵母双杂交 相互作用 

摘      要：AA12基因是胡宝成等人用PCR选择性抑制消减杂交方法筛选到的新的EST,后经Dot blot和Northern blot验证、并用RACE技术获得了其全长基因,该基因在A1-5细胞中高表达而在B4细胞中低表达。与B4细胞相比,A1-5具有非常强的抗辐射性并伴随不同寻常的G2延迟效应。我们将AA12与CHK1基因分别克隆到酵母双杂交载体pGBKT7和pGADT7中,将重组质粒导入酵母AH109与Y187中,在四缺平板SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp上检测报告基因HIS3和ADE2的表达情况,β-半乳糖苷酶活性分析和α-半乳糖苷酶活性分析检测lacZ 和MEL1报告基因表达情况。研究发现AA12和CHK1在酵母细胞水平存在相互作用。但AA12基因是否对A1-5细胞表现出的不同寻常的表型起关键作用,以及它与CHK1相互作用的机制尚不清楚。 为发现新的与AA12或CHK1相互作用蛋白,同时进一步验证这两个蛋白之间的相互作用,我们用AA12与Chk1基因分别克隆到酵母双杂交载体pGBKT7中,将前列腺组织cDNA文库插入到pACT2中,重组质粒转化酵母菌AH109,用同样方法检测报告基因HIS3、ADE2、lacZ 和MEL1的表达情况。同时用免疫印迹(Western blot)方法检测了AA12基因在酵母中的表达情况,结果表明,AA12基因能够在酵母细胞中正确表达。经过反复验证,以AA12为诱饵蛋白,共筛选得到30个阳性克隆,经验证得到两个与AA12相互作用蛋白,序列测定结果显示这两个基因序列相同,为同一克隆。BLAST检索显示此序列与已知的一种核糖体蛋白RPL41基因高度同源。而以CHK1为诱饵蛋白,共筛选得到102个阳性克隆,经验证得到四个与CHK1相互作用蛋白,测序鉴定结果其中有两个为相同序列,故只获得三个相互作用蛋白,经BLAST检索显示这三个基因都与染色体基因组蛋白序列同源。本课题为进一步研究新基因AA12的功能及其与CHK1的相互作用机制奠定了基础。这些蛋白与AA12和CHK1的相互作用还需进一步证实,有关的作用机理还需要进一步研究。