miR-98靶向Cyclin D2抑制糖尿病大鼠血管内皮细胞增殖的机制

作     者：李新新 

作者单位：滨州医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：谢书阳;李有杰

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：Cyclin D2 miR-98 2型糖尿病大鼠 基因表达 

摘      要：本论文分两部：第一部分研究miR-98在2型糖尿病SD大鼠血管内皮细胞增殖中的作用;第二部分研究miR-98下调Cyclin D2表达抑制大鼠主动脉血管内皮细胞(rat vascular aortic endothelial cells,RAOEC)细胞的增殖。一、miR-98在糖尿病SD大鼠血管内皮细胞增殖中的作用通过建立2型糖尿病大鼠模型,利用Real-time PCR检测miR-98在糖尿病大鼠血管内膜组织中的表达明显低于正常大鼠组织,推测miR-98在血管内皮细胞增殖中发挥作用。进一步Western blotting检测Cyclin D2的表达,其在糖尿病大鼠血管内膜组织中的表达明显高于正常大鼠组织,与cyclinD2相关的p-Rb表达升高,结果提示,cyclin D2和与其相关的Rb的磷酸化在血管内皮细胞增殖中发挥重要作用。在细胞水平,MTT检测高糖处理对RAOEC细胞增殖的影响,结果显示,高糖处理组细胞的增殖率明显高于低糖处理组。进一步检测高糖处理细胞后对细胞周期的影响,与高糖培养基处理组相比,正常组的细胞主要停滞在G1期,而高糖处理组的细胞主要进行分裂增殖。通过Real-time PCR检测高糖处理细胞后miR-98的表达,高糖处理组miR-98的表达明显低于低糖处理组(对照组)。进一步Western blotting检测Cyclin D2和p-Rb在高糖处理组的表达明显高于低糖处理组,结果显示,cyclin D2和与其相关的Rb的磷酸化在血管内皮细胞增殖中发挥重要作用。二、miR-98通过下调Cyclin D2表达抑制RAOEC细胞的增殖构建pcDNA-GFP-cyclin D2-3 UTR的载体,化学合成miR-98及反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO-98),共转染RAOEC细胞,利用荧光倒置显微镜和流式细胞术检测GFP的表达,结果显示,与对照组相比,转染miR-98组绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)的表达量显著下降;MTT检测转染miR-98后,细胞的增殖情况,实验结果显示,miR-98转染组细胞增殖受到抑制;进一步检测miR-98对细胞周期和细胞凋亡的影响,miR-98转染组的细胞停滞在G1期,促进了血管内皮细胞的凋亡,抑制了细胞的分裂增殖。在细胞水平,Real-time PCR检测转染miR-98后,miR-98的含量明显升高。Western blotting检测到转染miR-98后,Cyclin D2口p-Rb的表达明显低于对照组;另外,抗凋亡基因Bcl-2和NF-KB的表达降低;促凋亡基因BAX和Caspase9勺表达升高,推测miR-98抑制大鼠血管内皮细胞的增殖与上述因子变化有关。综上所述,Cyclin D2在2型糖尿病大鼠血管内皮细胞增殖中发挥作用,miR-98通过调节Cyclin D2的表达抑制大鼠血管内皮细胞的增殖。miR-98也可能通过影响l-2、NF-KB、BAX、Caspase9的表达抑制大鼠血管内皮细胞的增殖。