硝唑尼特的毒理学研究及其抗利什曼原虫作用机制初探

作     者：张德利 

作者单位：中国人民解放军军事医学科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：吴永魁

授予年度：2011年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：硝唑尼特 致突变性 生态毒性 利什曼原虫 蛋白质二硫键异构酶 

摘      要：在硝基咪唑和苯并咪唑问世三十年来,几乎没出现新的抗肠道寄生虫药物,与此同时,寄生虫感染率及其导致的死亡率仍然很高,在这种背景下,硝唑尼特(Nitazoxanide,NTZ)的出现显得特别重要。NTZ由勒马克实验室(Romark Laboratories)首创,是一种高效的广谱抗动物与人体寄生虫药物,1984年首次报道用于抗人体无钩绦虫(Taenia saginata)和微小膜壳绦虫(Hymenolepis nan)[1],现在越来越多的研究证明NTZ也表现出对厌氧细菌微生物和一些病毒的抵抗作用[2],还能有效地治疗人体肠道原生动物和蠕虫的感染。已在美国、部分拉丁美洲上市。在瑞士和法国,已获准在兽医领域应用,但是在我国尚未上市,也未见对NTZ的毒理学进行综合研究的报道,因此,对NTZ进行毒理学研究有助于对该药的研发和在国内兽医临床上的应用。 在NTZ的毒理学研究中,进行了致突变性试验及对斑马鱼和蚯蚓的急性毒性试验。NTZ的致突变性试验按《新兽药特殊毒性试验技术要求》进行。Ames试验采用平板渗入法,阳性对照为二氨基芴和丝裂霉素C,并设溶剂(DMSO)对照,做一次重复试验,在加与不加S9条件下,NTZ在250.0μg/皿以下对TA97、TA98、TA100、TA102的回复突变菌落数与溶剂对照组和自发回变菌落数相近,无剂量反应关系,500.0μg/皿以上有抑菌作用,表明NTZ对测试菌株无致突变性;小鼠骨髓细胞微核试验采用间隔24h给药法,剂量为2.5g/kg·bw、1.25g/kg·bw和0.625g/kg·bw,设溶剂对照组和环磷酰胺阳性对照组,每只鼠计数1 000个嗜多染红细胞(PCE),观察含有微核的PCE数,计算PCE/NCE,结果,NTZ 3个剂量组的微核率在自然出现率范围内,阳性对照组微核率为26.7‰,与各剂量组及溶剂对照组比较有显著性差异(P0.01),表明NTZ对小鼠骨髓PCE微核发生无影响;小鼠精子畸形试验分组与微核试验相同,采用每天给药1次,连续5d,喂养35d后处死动物,显微镜下观察精子畸形率,NTZ连续给药3d后,出现被毛蓬松,活动减弱,食欲减低,体重减轻,高剂量组个别小鼠出现死亡,尸检发现有坏死性肠炎病变,给药动物在停药2d后恢复正常,结果,3个剂量组精子畸形率与阴性对照组比较差异无显著性,与阳性对照组比较有显著性差异(P0.01),表明NTZ对小鼠精子畸形发生率无影响,各组精子畸形构成以不定型、无钩、香蕉形居多。 NTZ对斑马鱼和蚯蚓的急性毒性是评价生态毒性的重要指标,试验参照经济合作与发展组织(OECD)推荐的方法进行。斑马鱼急性毒性试验采用静水法,给药后记录24h、48h、72h和96h的临床表现并记录死亡数。斑马鱼急性中毒后,出现游动性减慢、呼吸困难和麻醉状态,鱼体周围出现白色絮状物,用药5h后出现死亡,死亡鱼体色和鳃颜色变淡,腹腔内容物偏黄,肠胃呈土黄色。鱼死亡率随NTZ浓度增高而增高,随时间的增加而增高。经计算,NTZ对斑马鱼24h LC50为2.312mg/L,95%可信限为2.125 mg/L.515mg/L;48h和72h LC50为2.033mg/L,95%可信限为1.782 mg/L.318mg/L;96h LC50为1.968mg/L,95%可信限为1.717 mg/L.256mg/L。按鱼类急性毒性分级标准,NTZ属高毒类物质。NTZ对斑马鱼的LC100为3.63mg/L,LC0为1.00mg/L,安全浓度≤0.472mg/L。 NTZ对赤子爱胜蚓的急性毒性试验采用滤纸法和土壤法。蚯蚓滤纸法接触NTZ后,出现活动性增强、有浅黄色液体渗出,而后活动性减低,24h和48h检查,身体变软,有的环带肿胀,有的节间沟深陷、断成多节,死亡蚓环带肿大、出血、糜烂,滤纸上有黄褐色渗出物,部分整条蚯蚓成串珠状,存活蚯蚓活动性减低。NTZ滤纸法对蚯蚓24h LC50为1.50μg/cm2,95%可信限为1.28μg/cm21.75μg/cm2;48h LC50为0.81μg/cm2,95%可信限为0.74μg/cm2.89μg/cm2,空白对照组蚯蚓正常。蚯蚓接触含不同浓度NTZ的土壤后无明显中毒症状,24h和48h检查,可见死亡蚓体色变淡、部分体段呈苍白色,身体变软、变细,有的身体糜烂,有断裂现象,或节间沟深陷整条蚯蚓成串珠状,死亡蚯蚓多出现在48h内,较高剂量组存活蚯蚓活动性减弱,较低剂量组活动性正常,部分身体颜色发黄。NTZ自然土壤法对蚯蚓24h LC50为119.440 mg/kg,95%可信限为103.72 mg/kg37.55mg/kg;48h至第4d LC50为108.44 mg/kg,95%可信限为95.92 mg/kg 22.60mg/kg;第7d LC50为98.45mg/