糖化酵母工程菌构建及其表达酶和产乙醇研究

作     者：刘振旺 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张爱联

授予年度：2010年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：淀粉酒精 糖化酶 α-淀粉酶 异淀粉酶 巴斯德毕赤酵母 酿酒酵母 

摘      要：由于对石油的过度依赖,能源危机和环境污染已成为制约各国经济发展,影响人类健康的主要因素。开发新能源已成为一项迫切的任务。生物乙醇是一种绿色的可再生能源,主要由纤维素质与淀粉质发酵获得,具有巨大生产潜能。 淀粉质转化乙醇早已进入商业规模,我国已形成相关产业链。分解支链淀粉的异淀粉酶和水解淀粉生成葡萄糖的糖化酶或α-淀粉酶是淀粉酿酒过程中必须添加的酶。P. pastoris是良好的外源基因表达宿主。本项目研究用P. pastoris表达α淀粉酶和异淀粉酶。通过PCR法扩增达a淀粉酶基因(a-amy)和异淀粉酶基因(iso),并使其基因的3’末端融合了His标签。构建P. pastoris表达载体(pGAP9K-α-amy和pGAP9K-iso).利用电转化技术将重组表达载体转化毕赤酵母GS115,经500-1,000μg/mL的G418抗生素筛选得到阳性菌株GS115(pGAP9K-α-amy)和GS115(pGAP9K-iso),将摇瓶表达产物进行分解淀粉和支链淀粉试验,筛选高表达重组子作为工程菌。在生物反应器中高密度发酵工程菌株GS115(pGAP9K-α-amy) 56h时,生物量A600为186,表达α-AMY产量最高约为125mg／L,表达产物具有水解淀粉活性,活力为68.32U／ml。 之所以在酿酒过程中需添加糖化淀粉的酶类是因为酿酒酵母缺乏这些酶。这些酶的生产增加了淀粉质原料乙醇的成本。 本课题应用DNA操作将异淀粉酶和糖化酶基因重组于京龙一号酿酒酵母。通过G418浓度梯度筛选、淀粉平板活性筛选等方法,筛选出高拷贝、并有水解支链淀粉活性的重组子ScYIpGI,摇瓶表达表明出现目标蛋白。分别用于10%木薯淀粉培养基、10%可溶性淀粉培养基发酵,证明ScYIpGI具有糖化能力,并且4d内,发酵液酒精浓度分别为4.17%和4.58%,淀粉利用率为57.5%、61.2%。结果证明,本实验改良后的酒酵母工程菌可表达糖化酶和异淀粉酶,具有水解淀粉的活性,可应用于直接发酵淀粉生产乙醇。