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生物化学与生物物理进展 2000年第2期27卷 151-154页

作者：欧阳立明张惠展张嗣良刘志敏华东理工大学生物工程学院上海200237 军事医学科学院生物工程研究所北京100071

巴斯德毕赤酵母是一种近年来广泛使用的基因表达系统 ,它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等许多优点 .综述了该系统在载体类型、载体元件 (包括启动子、选择标记和信号肽序列 )、受体类型。

关键词：巴斯德毕赤酵母基因表达系统载体受体

巴斯德毕赤酵母Orm1蛋白在细胞生长和内质网功能维持方面的功能

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微生物学通报 2017年第4期44卷 755-765页

作者：梁晨张萌喻其林邢来君李明春南开大学生命科学学院微生物系分子微生物学与技术教育部重点实验室天津300071

【目的】鉴定巴斯德毕赤酵母ORM1基因;研究ORM1基因缺失对毕赤酵母生长、内质网压力应答、细胞钙稳态调节和活性氧水平等方面的影响。【方法】利用生物信息学软件对毕赤酵母Orm1蛋白进行序列比对和分析;利用PCR介导的同源重组法构建orm... 详细信息

【目的】鉴定巴斯德毕赤酵母ORM1基因;研究ORM1基因缺失对毕赤酵母生长、内质网压力应答、细胞钙稳态调节和活性氧水平等方面的影响。【方法】利用生物信息学软件对毕赤酵母Orm1蛋白进行序列比对和分析;利用PCR介导的同源重组法构建orm1Δ缺失菌株,将回补质粒p IB1-ORM1转入orm1Δ菌株构建回补菌株;研究ORM1基因缺失对毕赤酵母生长的影响;以Fluo-3 AM染色法测定胞质钙含量;以DCFH-DA染色法分析胞内活性氧水平;以实时荧光定量PCR技术研究ORM1基因缺失对毕赤酵母非折叠蛋白应答、钙稳态和抗氧化系统基因表达的影响;使用试剂盒分析毕赤酵母抗氧化系统过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽(GSH)的含量。【结果】在毕赤酵母基因组数据库中比对出酿酒酵母Orm1和Orm2的同源蛋白,并将该蛋白编码基因命名为ORM1;毕赤酵母ORM1基因缺失导致细胞生长受到明显抑制,对衣霉素引起的内质网压力敏感性增强,非折叠蛋白应答激活,细胞钙稳态紊乱,活性氧积累,抗氧化系统激活。【结论】由于非折叠蛋白应答、钙稳态调节、活性氧积累等均与内质网功能息息相关,因此,巴斯德毕赤酵母ORM1基因编码的Orm1蛋白在细胞生长及内质网正常功能的维持过程中发挥重要作用。

关键词：巴斯德毕赤酵母 Orm 内质网压力钙稳态活性氧

巴斯德毕赤酵母SUT2和ATG26响应甲醇代谢机制

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东北农业大学学报 2021年第5期52卷 41-48页

作者：王鹏程李翔赵天宇战春君白仲虎杨艳坤江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

为寻找巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)中甲醇代谢潜在调控因子,通过转录组数据分析,发现受甲醇显著诱导而被甘油所抑制的SUT2(Sterol up take 2,固醇摄取基因2)。固醇是过氧化物酶体膜重要组成部分,过氧化物酶体是甲醇代谢重要... 详细信息

为寻找巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)中甲醇代谢潜在调控因子,通过转录组数据分析,发现受甲醇显著诱导而被甘油所抑制的SUT2(Sterol up take 2,固醇摄取基因2)。固醇是过氧化物酶体膜重要组成部分,过氧化物酶体是甲醇代谢重要场所。为探究SUT2参与甲醇代谢功能机制,通过敲除及过表达SUT2基因,检测***在不同碳源、时间点、氧含量条件下胞内麦角固醇含量及AOX1(Alcohol oxidase 1)酶活性变化;发现在甲醇培养基中SUT2通过促进胞内麦角固醇合成及过氧化物酶体膜形成,参与甲醇代谢。与之相反,ATG26(Autophagy-related gene 26,自噬相关基因26)通过促进麦角固醇合成甾醇葡萄糖苷,减少过氧化物酶体膜形成。最后,建立***中SUT2及ATG26调控过氧化物酶体膜麦角固醇含量,响应甲醇代谢初步模型。

关键词：巴斯德毕赤酵母 SUT2 ATG26 麦角固醇过氧化物酶体

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巴斯德毕赤酵母的基因改造研究进展

药物生物技术 2024年第6期31卷 718-724页

作者：何旭晖纪雪梅中国药科大学生命科学与技术学院

巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养型酵母，可以利用甲醇、葡萄糖、甘油作为碳源，具有生产成本低、发酵密度高、表达水平较高，副产物少的优势，目前该系统已成功用于胰岛素、胶原蛋白、抗体类药物的生产。然而，作为一种应用于工业生产的... 详细信息

巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养型酵母，可以利用甲醇、葡萄糖、甘油作为碳源，具有生产成本低、发酵密度高、表达水平较高，副产物少的优势，目前该系统已成功用于胰岛素、胶原蛋白、抗体类药物的生产。然而，作为一种应用于工业生产的表达系统，其具有如蛋白无法分泌表达、表达量低、翻译后修饰不理想、诱导剂甲醇危险不易存放等缺陷。随着基因编辑工具的发展，研究者广泛开展了对巴斯德毕赤酵母基因水平、转录调控和代谢途径的改造，以扩大巴斯德毕赤酵母产品的范围。文章主要介绍了常用的毕赤酵母基因编辑工具研究现状，并简述了基因编辑工具在毕赤酵母糖基化人源化及转录调控改造中的最新应用，最后对毕赤酵母基因编辑研究的发展做出了展望。

关键词：巴斯德毕赤酵母甲基营养型酵母 CRISPR/Cas9 Cre/LoxP 糖基化底盘细胞

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巴斯德毕赤酵母(***)高密度发酵研究进展

生物技术通报 2014年第3期30卷 42-49页

作者：闵兆升郭会明颜旭洪厚胜南京工业大学理学院南京210009 南京工业大学生物与制药工程学院南京210009

高密度发酵已经成为提高毕赤酵母目的蛋白表达量的关键技术之一,而其中发酵工艺又是高密度发酵的一个重要因素。主要从巴斯德毕赤酵母遗传学特性、表达宿主菌、表达载体、外源蛋白的表达方面进行了阐述,并从毕赤酵母工程菌的选择、培养... 详细信息

高密度发酵已经成为提高毕赤酵母目的蛋白表达量的关键技术之一,而其中发酵工艺又是高密度发酵的一个重要因素。主要从巴斯德毕赤酵母遗传学特性、表达宿主菌、表达载体、外源蛋白的表达方面进行了阐述,并从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计、发酵过程关键参数调控以及甲醇诱导等方面阐述毕赤酵母的高密度发酵。最后,提出了巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中存在的问题并进行展望。

关键词：巴斯德毕赤酵母表达系统高密度发酵过程参数甲醇

巴斯德毕赤酵母不同生长阶段内参基因的筛选与验证

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微生物学通报 2022年第11期49卷 4586-4597页

作者：吕梦娇战春君白仲虎杨艳坤江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江南大学江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心江苏无锡214122

【背景】巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)是一种甲基营养型酵母,近年来作为生产重组蛋白和构建生物合成途径的细胞工厂受到广泛关注。实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)是巴斯德毕赤酵母表达系统研究中一种快... 详细信息

【背景】巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)是一种甲基营养型酵母,近年来作为生产重组蛋白和构建生物合成途径的细胞工厂受到广泛关注。实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)是巴斯德毕赤酵母表达系统研究中一种快速、高效的基因表达水平检测技术,但需要进行归一化处理才能保证所得结果的可靠性。【目的】筛选并验证巴斯德毕赤酵母在不同生长阶段最稳定的内参基因用于精准归一化RT-qPCR的结果。【方法】通过转录组数据分析初步筛选出16个候选内参基因(rps8b、rpl35a、rpl10、eif5a、rpl19a、por1、rpl23b、0887、tif1、ole1、rpl14b、gs、sun、sdh2、trx1和ccp1)。通过RT-qPCR技术得到候选内参基因的Ct值,利用qBASE软件中的geNorm程序综合NormFinder算法评估内参基因的表达稳定性。【结果】通过geNorm分析得出精准归一化所需的最佳内参基因个数为2,最稳定的基因是rpl19a和tif1,NormFinder分析得到稳定性最高的内参基因为tif1。此外,利用甲酸脱氢酶编码基因fdh和乙醇脱氢酶甲醛脱氢酶双功能酶的编码基因afdh对候选内参基因进行验证。【结论】巴斯德毕赤酵母不同生长阶段的RT-qPCR进行精准归一化需要tif1和rpl19a这2个内参基因,为相关功能基因的表达定量提供了可靠的分析依据,补充了RT-qPCR分析中的内参基因,为巴斯德毕赤酵母不同生长阶段的基因表达调控及其应用研究提供了新的参考。

关键词：巴斯德毕赤酵母内参基因实时荧光定量PCR geNorm NormFinder

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巴斯德毕赤酵母甘油转运体的发现及功能研究

中国生物工程杂志 2017年第7期37卷 48-55页

作者：战春君李翔刘国强刘秀霞杨艳坤白仲虎江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室无锡214122

目的:分离确认巴斯德毕赤酵母中甘油转运体并初步研究其功能。方法:通过生物信息学方法从NCBI数据库中查找可能的甘油转运体(gt1,GeneID:8197545),并通过DAS软件对其跨膜结构域进行预测。通过PCR方法扩增该基因并将其与EGFP融合克隆到pP... 详细信息

目的:分离确认巴斯德毕赤酵母中甘油转运体并初步研究其功能。方法:通过生物信息学方法从NCBI数据库中查找可能的甘油转运体(gt1,GeneID:8197545),并通过DAS软件对其跨膜结构域进行预测。通过PCR方法扩增该基因并将其与EGFP融合克隆到pPICZ B及pRS424载体进行亚细胞定位;同时将其与pRS424载体连接后电转到粟酒裂殖酵母中进行异源表达确定其功能;通过同源重组敲除gt1基因并在不同培养基中培养测定aox1基因表达量。结果:生物信息学显示与酿酒酵母中已经证明的甘油转运体(sugar transporter 1,stl1)类似,GT1蛋白同样为具有疏水结构域的跨膜蛋白,同时亚细胞定位结果显示GT1蛋白定位于细胞膜上,包含有gt1基因的粟酒裂殖酵母可以在以甘油作为唯一碳源的培养基中生长而野生型不可以;在Δgt1突变体中aox1基因可以获得组成型表达。结论:分离并确认了巴斯德毕赤酵母中的甘油转运体GT1,并初步证明其与aox1基因甘油阻遏相关。

关键词：巴斯德毕赤酵母甘油转运体甘油阻遏亚细胞定位同源重组

巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达rHC MVp的研究

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暨南大学学报（自然科学与医学版） 2005年第2期26卷 162-167页

作者：余巍谢琪璇潘善培肖銮娟熊波李文星董志炜暨南大学生殖免疫研究所广东广州510632

目的:提高人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)在巴斯德毕赤酵母中的表达量,并进行发酵罐高密度发酵。方法:将生长培养基的菌体离心后等量接入诱导培养基中(包括不同体积分数的甲醇、pH值)培养,通过菌体密度检测和发酵液上清的SDS -PAGE结果分... 详细信息

目的:提高人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)在巴斯德毕赤酵母中的表达量,并进行发酵罐高密度发酵。方法:将生长培养基的菌体离心后等量接入诱导培养基中(包括不同体积分数的甲醇、pH值)培养,通过菌体密度检测和发酵液上清的SDS -PAGE结果分析不同条件、不同诱导时间对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响,并依据优化条件进行高密度发酵。结果:摇瓶培养时,转化子在体积分数1%的甲醇pH 6 0的条件下诱导72h ,A6 0 0 (菌体密度)为4 5 2 ,目的蛋白表达量达到10 2mg/L。2L发酵罐进行了高密度发酵,经体积分数1%甲醇诱导4 8h ,最终A6 0 0 (菌体密度)达到12 4 ,每升发酵液中含目的蛋白5 7 2 1mg。结论:通过条件优化,进行高密度发酵,获得大量的rHCMVp。

关键词：重组人巨细胞病毒嵌合肽巴斯德毕赤酵母高密度发酵

人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达

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华南理工大学学报（自然科学版） 2003年第1期31卷 26-29页

作者：董燕王捷杨连生张宏斌郑文岭华南理工大学食品与生物工程学院广东广州510640 广州军区总医院医学实验科广东广州510010

以PCR方法扩增人bsp基因 ,与分泌型表达载体 pPICZαA重组 ,重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株 ,获得的GS115 /pPICZαA_hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP .SDS_PAGE和Westernblot分析结果表明 ,产物的分子质量接近 6 6ku ,能发生特... 详细信息

以PCR方法扩增人bsp基因 ,与分泌型表达载体 pPICZαA重组 ,重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株 ,获得的GS115 /pPICZαA_hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP .SDS_PAGE和Westernblot分析结果表明 ,产物的分子质量接近 6 6ku ,能发生特异性抗原

关键词：人骨唾液酸蛋白巴斯德毕赤酵母基因表达分泌型表达载体 PCR方法抗原-抗体反应

巴斯德毕赤酵母表达人微小纤溶酶原的放大研究

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药物分析杂志 2011年第1期31卷 66-70页

作者：陈武莫炜张艳玲宋后燕广东药学院生命科学与生物制药学院广州510006 复旦大学分子医学教育部重点实验室上海210032

目的:研究巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达重组人微小纤溶酶原(rh-mPlg)的放大工艺。方法:分别采用1 L摇瓶、7.5 L发酵罐对Pichia pastoris工程菌rh-MPLG/GS115进行高密度培养、甲醇诱导表达。摇瓶培液经2步纯化:SP-Seph-arose FF... 详细信息

目的:研究巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达重组人微小纤溶酶原(rh-mPlg)的放大工艺。方法:分别采用1 L摇瓶、7.5 L发酵罐对Pichia pastoris工程菌rh-MPLG/GS115进行高密度培养、甲醇诱导表达。摇瓶培液经2步纯化:SP-Seph-arose FF、Superdex 75;发酵罐培液经3步纯化:超滤、Sephacryl S-100、Q-Sepharose FF,活性组分透析后冷冻干燥。以组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)激活rh-mPlg,纤维蛋白平板测定其纤维蛋白溶解活性,计算并比较2种制备方法所获rh-mPlg比活性及得率。结果:采用1 L摇瓶和7.5 L发酵罐发酵可分别获得34 mg.L-1培液、210 mg.L-1培液的得率,经纯化后rh-mPlg纯度分别为95%和97%,比活性分别为20.6和23.0 ***-1。结论:以发酵罐生产rh-mPlg,可显著提高其产量,且比活性与摇瓶表达相近,验证了放大生产的可行性。

关键词：巴斯德毕赤酵母纤溶酶原表达纯化放大