α-螺旋抗癌肽L-K6对人乳腺癌MCF-7细胞的内化机制研究

作     者：宫贤阁 

作者单位：辽宁师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：尚德静;王澈

授予年度：2015年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 1002[医学-临床医学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：抗癌肽 抗癌活性 内吞作用 磷脂酰丝氨酸 

摘      要：L-K6是中国林蛙皮肤抗菌肽Temporin-1CEb的改造肽。本实验室前期研究表明,L-K6对多种乳腺癌细胞的增殖有显著的抑制作用。跨膜电位检测显示L-K6对乳腺癌MCF-7的细胞膜无明显的去极化作用,对细胞膜通透性影响较小并且对细胞膜没有明显的破坏作用。这些结果提示L-K6对乳腺癌MCF-7细胞的作用靶点可能是胞内物质而非细胞膜。本论文初步探究L-K6进入细胞膜方式及作用机制。首先,我们利用激光共聚焦显微镜和超高分辨率显微镜研究L-K6对乳腺癌MCF-7细胞的细胞膜、细胞骨架、细胞核形态结构的影响,结果显示L-K6作用1小时,MCF-7细胞膜基本保持完整,细胞骨架形态清晰,但是细胞核荧光减弱,并随L-K6浓度增大核荧光减弱程度增加。说明L-K6以某种方式进入细胞后,作用于细胞核。其次,我们利用流式细胞仪、荧光酶标仪、超高分辨率显微镜研究L-K6的入膜方式。检测结果显示,用内吞抑制剂甲基-β-环糊精(M-β-CD)、阿米洛利(EIPA)、氯丙嗪(CPZ)、细胞松弛素D(CyD)处理细胞后,FITC-L-K6的内化量均有不同程度的减少,证明L-K6主要以内吞的方式进入MCF-7细胞,其中细胞松弛素D(CyD)对L-K6内化量的影响最为显著。为探究L-K6内化过程的能量依赖性,我们进行了低温试验,实验结果显示,在4oC低温环境中L-K6的内化量与37oC环境中L-K6的内化量相比显著降低,说明L-K6的内化具有能量依赖性。L-K6是阳离子抗菌肽,其首先通过静电作用与MCF-7细胞表面带负电荷的磷脂酰丝氨酸(PS)结合,聚集在MCF-7细胞表面,达到内吞作用的启动。等温滴定微量热仪(ITC)实验证明了L-K6与PS发生特异性结合,结合比接近1:1;CD色谱实验也证明PS可以诱导L-K6形成α-螺旋结构,并随着PS浓度增加,L-K6形成α-螺旋含量增加。而MCF-7细胞膜表面带负电荷的HS、CS和神经节苷脂不参与L-K6的内化。