Gasdermin D在金黄色葡萄球菌皮肤感染中的作用

作     者：周风华 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨勇军

授予年度：2018年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：Gasdermin D 金黄色葡萄球菌 皮肤感染 CXCL1 

摘      要：Gasdermin D(GSDMD)属于Gasdermin蛋白家族成员,是炎性体依赖的细胞死亡方式--细胞焦亡的执行者,该发现是近年来天然免疫研究领域的重要进展之一。该发现催生了人们对GSDMD的炎性体依赖和非依赖生物学功能,以及在感染、炎症等疾病中的功能作用的研究热情。金黄色葡萄球菌是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性致病菌,可引起动物和人类多种疾病,如皮炎、肺炎、肠炎、乳腺炎、关节炎等,严重时导致败血症。近年来,随着金黄色葡萄球菌多重耐药菌株的出现,其高致病性和发病率引起人们广泛关注。为了从宿主角度发现金黄色葡萄球菌的防治靶标,本论文针对GSDMD在金黄色葡萄球菌皮肤感染中的作用和机制进行了研究。通过利用野生型(WT)和GSDMD-/-小鼠构建金黄色葡萄球菌皮肤感染模型,我们首先分析了GSDMD对金黄色葡萄球菌感染性皮炎的影响。对两种基因型小鼠进行了如下检测:利用游标卡尺测量并计算皮肤脓肿面积大小;采用H&E法检测皮肤组织的病理损伤情况;采用平板法统计分析皮肤组织荷菌数情况;采用ELISA法检测皮肤组织中炎性细胞因子的分泌情况;采用免疫组织化学法检测炎性细胞的浸润情况。结果显示,与WT小鼠相比,GSDMD-/-小鼠皮肤脓肿面积更大(第2天至第8天,p0.01;第9天,p0.05)、组织病理损伤更为严重、组织荷菌定殖更多(p0.01)、CXCL1分泌量显著增多而IL-1β显著减少(p0.05)、中性粒细胞和巨噬细胞浸润增多。由此说明:GSDMD显著抑制金黄色葡萄球菌皮肤感染。随后,我们对GSDMD调节金黄色葡萄球菌皮肤感染的机制进行研究。GSDMD可被Caspase-1、Caspase-11等剪切,释放的N末端在细胞膜上打孔,介导细胞焦亡效应甚至IL-1β和IL-18的释放。因此,我们借助Caspase-1/11-/-小鼠,对比分析其与GSDMD-/-小鼠在金黄色葡萄球菌皮肤感染中的反应差异。结果发现,尽管Capase1/11-/-小鼠和GSDMD-/-小鼠均呈现细胞因子IL-1β分泌障碍,但二者的表型并不完全相同:Capase1/11-/-小鼠近似于WT小鼠,其脓肿大小、细菌定殖量和组织病理损伤轻微增加,但无明显差异,而GSDMD-/-小鼠与WT小鼠存在明显差异。有趣的是,三种基因型小鼠的CXCL1分泌模式与脓肿大小、细菌定殖量相一致。表皮细胞和浸润的炎性细胞等均是皮肤免疫屏障的重要组成部分。我们接着采用免疫组化法分析皮肤组织中GSDMD的表达情况,结果发现GSDMD主要在炎性细胞中表达。借助于小鼠骨髓来源巨噬细胞作为研究模型,我们进而在细胞水平上分析GSDMD对CXCL1分泌的影响及其调节通路。GSDMD-/-细胞IL-1β分泌比WT细胞显著减少(p0.05),证实GSDMD参与炎性体活化功能。但更为重要的是,GSDMD-/-细胞CXCL1分泌显著增多(p0.0001),与在体实验结果相一致。应用Western blot分析Ik B-α,p-Ik B-α,p-NF-k B P65蛋白表达量,发现GSDMD基因缺失后NF-k B信号活化增强。接着,我们分析皮肤组织中NF-k B信号通路的活化情况,结果与细胞实验结果相一致。上述结果说明GSDMD可能通过负调控NF-k B信号活化抑制CXCL1的分泌。增多的CXCL1是否介导GSDMD基因缺失效应,是我们需要进一步回答的问题。我们应用CXCL1抑制剂SB225002进行验证。结果发现CXCL1抑制剂可以明显缓解GSDMD-/-小鼠的组织病理损伤,并且可以限制金黄色葡萄球菌在皮肤炎症中的定殖。综上所述,本论文揭示GSDMD通过抑制NF-k B-CXCL1信号,实现其抗金黄色葡萄球菌皮肤感染作用。