胚肝细胞诱导肝癌细胞株HepG2再分化中调控环路的重建

作     者：刘德美 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：齐锦生

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胚肝细胞 肝癌细胞Hep G2 HNF4α HNF1α HNF6 USF1 LETFs si-HNF4α 

摘      要：目的:全球癌症数据显示,肝癌发病率是世界所有恶性肿瘤的第5位,每年约有70万人死于肝癌。我国是全球肝癌发病率最高的国家,肝癌发病人数超过全球发病人数的50%,其中90%以上为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。然而,目前对于HCC的治疗存在着切除率低、肝源有限、毒副作用大、复发率高等问题,即使在发达国家,5年的相对生存率不到15%,严重威胁着人类生命健康。因此,阐明HCC的发病机制,寻求有效根除HCC的方法,成为生命科学界和医学界的重点和难点。早在20世纪70年代,Pierce等人提出了肿瘤是一个发育生物学问题的理论。更多的研究证实,早期胚胎发育和肿瘤发生在许多方面存在着惊人的相似性,如早期胚胎细胞的分化和增殖机制与肿瘤细胞的分化和增殖机制;早期胚胎植入与肿瘤的侵袭性转移;两者的免疫逃避机制等。Misirlioglu等证实肿瘤细胞有胚胎性基因的表达,如甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和胰胚抗原(pancreatic oncotetal antigen,POA)等;继而,Dvorak等研究发现胚胎植入子宫内膜的过程也有大量肿瘤形成过程中癌基因的表达。Hochedlinger等也同样证实了胚胎微环境可能存在调控肿瘤细胞向特定细胞分化并改变其恶性表型的机制。据此,导师齐锦生教授提出,胚胎细胞诱导肿瘤细胞的再分化具有组织和时间特异性,用特定发育阶段的胚肝细胞与肝癌细胞Hep G2共培养,可诱导肝癌细胞Hep G2的再分化,且已经实验证实,本实验旨在此基础上进一步探讨诱导分化过程中的主要分子机制。Young等人发现肝细胞中,HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之间通过相互调节及自我调节作用形成了高度关联的核心转录调控环路。相关研究也发现,肝富集转录因子(Liver enriched transcription factors,LETFs)包括C/EBP、DBP、HNF3、HNF1、HNF4、HNF6在胚肝的发育和分化过程中起着至关重要的作用。HNF4α是调节肝细胞分化和功能特异性的关键因子,其表达维持着肝正常的分化状态和功能,表达缺失则会刺激肝细胞增殖导致HCC。因此,HNF4α可看作HCC的抑癌基因,可能成为治疗HCC的一个新靶点。本实验小组前期试验证明,13.5天和14.5天的胚肝细胞与肝癌细胞Hep G2细胞共培养48h后,Hep G2细胞生长明显抑制,且部分细胞回缩、变圆,最终崩解;Hep G2细胞中分化标志HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1在转录水平和蛋白水平均上调,原癌基因c-Myc在转录水平和蛋白水平均下调;Hep G2细胞中AFP蛋白含量明显下降。说明胚肝细胞可诱导肝癌细胞的再分化,且具有组织和时间特异性。然而,肝癌细胞Hep G2再分化过程是否是重建了Hep G2细胞中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1的核心调控环路;HNF4α是否是此调控环路的核心因子;仍需进一步的实验证明。本实验旨在在前期实验结果的基础上,进一步揭示胚肝细胞诱导肝癌细胞再分化的主要分子机制。首先用13.5d的胚肝细胞与肝癌细胞Hep G2共培养48h后,利用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP)技术,检测Hep G2细胞中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1的核心调控环路的重新建立。在转染si RNA-HNF4α(si-HNF4α),敲低Hep G2细胞中HNF4α的表达,检测共培养后,Hep G2细胞中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1转录水平和蛋白水平的变化,进一步证明HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之间的相互调控作用;利用免疫荧光法检测Hep G2细胞中AFP的表达变化;探明了阻断HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之间的调控环路后,对胚肝细胞诱导肝癌细胞的再分化过程的影响。据此,探讨胚肝细胞诱导肝癌细胞再分化的主要分子机制,为治疗HCC提供实验依据。方法:1细胞的培养Hep G2细胞:Hep G2细胞用含1%非必需氨基酸和10%新生牛血清的DMEM高糖培养基培养,0.25%的胰蛋白酶消化传代,接种于100ml培养瓶中,在37℃、5%CO2培养箱中培养。原代胚肝细胞分离及培养:采用Ⅳ胶原酶消化法,从孕鼠腹中取得胎鼠,分离出胚肝,将胚肝组织剪成组织块,Ⅳ胶原酶消化胚肝组织块,成功分离为单个胚肝细胞;多次重复差速贴壁法除去成纤维细胞,纯化胚肝细胞;高糖DMEM培养胚肝细胞。2实验设计与分组:(1)诱导Hep G2细胞再分化的过程中,检测HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之间的相互调节作用,实验分成2组:untr