粒细胞样髓源性抑制细胞自噬对小鼠Lewis肺癌移植瘤发展的影响

作     者：郭红叶 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王胜军

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：粒细胞样髓源性抑制细胞 肿瘤细胞培养上清 细胞自噬 辅助性T细胞1型 细胞毒性T细胞1型 精氨酸酶1 活性氧 

摘      要：目的观察Lewis lung carcinoma(LLC)细胞株来源的细胞培养上清(tumor cellconditioned medium,TCCM)对粒细胞样髓源性抑制细胞(granulocytic myeloidderived suppressor cells,G-MDSC)自噬的影响;研究肿瘤微环境下的G-MDSC自噬对其自身生存与免疫抑制功能的影响;研究G-MDSC自噬对小鼠Lewis肺癌移植瘤发展的影响。方法1.G-MDSC分离及鉴定构建小鼠Lewi s肺癌移植瘤模型,磁珠分选脾脏G-MDSC,标记细胞表面Ly-6G、Ly-6C和CD11b后,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测其纯度;将分离得到的细胞涂片后进行瑞士-吉姆萨复合染液染色,观察细胞形态。***细胞株来源的TCCM的制备Lewis细胞用含有10%NBCS(newborn calf serum)的DMEM高糖培养液培养,待细胞汇合度达到90%的时候,用无血清的DMEM替换培养液,培养24h后,收集上清。***抑制G-MDSC凋亡与上调ROS(Reactive oxygen species,ROS)用不同浓度的TCCM处理G-MDSC12h、24h,Annexin V/PI染色法,检测细胞凋亡情况,DCFDA染色后FCM检测对细胞效应分子ROS的影响。***促进G-MDSC自噬的检测磁珠分选得到的G-MDSC在含有TCCM和氯喹(Chloroquine,CQ)的10%FBS(fatal bovine serum)RPMI 1640刺激2h、4h,收集细胞,提取总蛋白,WB(western blot)检测自噬小体形成标志物LC3Ⅱ(light chain 3Ⅱ)的水平。5.自噬抑制G-MDSC凋亡的检测磁珠分选获得G-MDSC,在含有TCCM和3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA自噬的抑制剂)RPMI 1640中培养12h、24h,收集细胞,Annexin V/PI染色,FCM检测自噬对G-MDSC生存的影响。6.自噬上调G-MDSC功能的检测将G-MDSC在含TCCM和3-MA的RPMI 1640中培养。培养12h,收集细胞,与小鼠脾脏CD4T细胞共培养,培养体系中加入抗CD3/CD28抗体,形成CD4T细胞增殖体系,通过3H-胸腺嘧啶核苷([3H]-thymidine,3H-Td R)掺入法检测CD4T细胞增殖情况。培养12h、24h,收集细胞,DCFDA染色后FCM检测ROS的表达;提取总蛋白检测精氨酸酶(arginase 1,ARG1)活性。7.G-MDSC自噬对小鼠Lewis肺癌移植瘤发展的影响构建小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,分别在16、23d,尾静脉注射3-MA阻断自噬的G-MDSC,观察小鼠移植瘤生长情况,FCM检测分泌IFN-γ的辅助性T细胞1型(helper T cell type 1,Th1)和细胞毒性T细胞1型(cytotoxic T lymphocytes type 1,Tc1)的比例。结果1.在体外,将不同浓度的TCCM加入到对G-MDSC培养体系中,FCM检测刺激12h、24h对细胞生存与效应分子ROS的影响。结果显示TCCM有利于G-MDSC在体外存活,存在浓度依赖效应;TCCM上调G-MDSCs的效应分子ROS的水平。2.将G-MDSC在含有TCCM和氯喹(Chloroquine,CQ)RPMI 1640中培养2h、4h,WB检测细胞中LC3Ⅱ水平。结果显示与对照组相比,TCCM处理2、4h上调了胞内LC3Ⅱ水平,表明了肿瘤微环境中,G-MDSC自噬的水平会上调(P0.01)。3.选取TCCM占培养体系体积的1/2来研究自噬对G-MDSC的影响,用3-MA抑制自噬,体外培养24h,观察抑制自噬对G-MDSC在体外存活的影响。结果显示,与1/2TCCM组相比,1/2TCCM+3-MA组活细胞比例降低,结果具有统计学差异(P0.05),表明抑制自噬,不利于G-MDSC在体外存活。4.体外检测G-MDSC对CD4T细胞增殖的影响,结果显示1/4TCCM+3-MA组与1/4TCCM组相比,在抑制了自噬后,G-MDSC对CD4T细胞增殖的抑制作用变弱,结果具有统计学差异(P0.05)。1/2TCCM+3-MA组与1/2TCCM组相比,G-MDSC抑制CD4T细胞增殖作用变弱,结果也具有统计学差异(P0.05)。表明抑制G-MDSC自噬后减弱了其对CD4T细胞增殖的抑制作用。5.体外培养12h,提取细胞总蛋白,检测ARG1活性结果显示,1/2TCCM+3-MA组与1/2TCCM组相比,在抑制了自噬后,G-MDSC细胞中ARG1活性降低,结果具有统计学差异(P0.01)。6.