水杨酸诱发的H2O2对丹参抗氧化系统的影响

作     者：行冰玉 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：董娟娥

授予年度：2014年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：丹参 培养细胞 水杨酸 聚丙烯酰胺电泳 抗氧化防护系统 

摘      要：以丹参(Salvia miltiorrhiza Bung)愈伤组织为材料，通过添加水杨酸(Salicylic acid，SA)诱导子诱导丹参愈伤组织H2O2迸发，进一步通过使用叶绿体光合电子传递链、NADPH氧化酶和POD等H2O2产生途径的抑制剂阻断H2O2产生，考察SA诱发的H2O2对丹参超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)的活性、渗透调节物质含量和膜脂过氧化产物含量的影响，旨在明确以SA为外源诱导子诱导丹参培养细胞特异位点产生的H2O2对其抗氧化系统的影响，为揭示SA刺激后引起丹参细胞抗逆反应的机制提供基础研究。取得了以下主要结论： 1.丹参愈伤组织中含有完成的叶绿体。在光照强度(2000000Lx)下生长的丹参愈伤组织疏松翠绿，细胞内叶绿体结构功能完整。在透射电镜下观察到其中叶绿体数量丰富，在细胞边缘排列整齐，基粒片层排列紧密，清晰可见。通过指标测定发现丹参愈伤组织中叶绿素a与叶绿素b含量比值接近3∶1，符合植物生理学特征。 2. SA处理可引起丹参愈伤组织H2O2迸发，且诱导呈最适浓度型特征。15.6252.5mg·L-1的SA对丹参愈伤组织H2O2的生成均有促进作用，其中20.832.5mg·L-1的SA作用效果较佳，高浓度(25mg·L-1)的SA诱导长时间后由于造成细胞伤害而导致H2O2的合成能力降低。22.5mg·L-1诱导效果最强(为照组的2.3倍)。 3. SA处理可激发叶绿体产生H2O2，激活丹参抗氧化系统。SA处理引起抗氧化酶(SOD、CAT和POD)活性升高、膜脂过氧化产物丙二醛含量和渗透调节物质还原型谷胱甘肽含量的增加，用阻断叶绿体光合电子传递链产生H2O2途径的抑制剂敌草隆(DCMU)处理后，三种酶活性降低，丙二醛和还原型谷胱甘肽含量降低。聚丙烯酰胺电泳分析三种酶的同工酶谱带结果与生理检测结果一致。说明SA可诱导叶绿体产生H2O2，激活丹参的抗氧化防护系统以清除多余的ROS，保证细胞的正常代谢。 4. SA处理可诱导丹参愈伤组织NADPH氧化酶和POD产生H2O2，进一步引起SOD、CAT和POD活性的升高，聚丙烯酰胺电泳分析同工酶条带与生理检测结果一致;SA处理提高了丙二醛和还原型谷胱甘肽含量。分别用NADPH氧化酶和POD的抑制剂咪唑和叠氮钠处理，阻断了SA诱发的H2O2产生，导致SOD、POD和CAT活性降低，丙二醛和还原型谷胱甘肽含量降低。说明SA诱导了来源于NADPH氧化酶和POD的H2O2产生，激活了丹参愈伤组织的抗氧化系统来清除多余的ROS，维持植物正常的生理活动。以上结果明确了SA诱发特异位点产生的H2O2对丹参抗氧化系统的影响，为进一步揭示诱导子诱发的丹参抗逆反应提供了理论基础。