住院患者粪便中产NDM超级细菌调查及基因分型研究

作     者：程灿灿 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：芮勇宇

授予年度：2014年

学科分类：1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：NDM KPC IMP VIM 整合子 ERIC 16S rRNA 

摘      要：研究背景与目的 随着各种抗菌药物的临床广泛使用,多重耐药甚至泛耐药细菌不断出现,使临床感染的治疗更为复杂。近年来,碳青霉烯耐药的革兰阴性超级细菌的快速传播和流行越来越引起全球关注、甚至恐慌。产碳青霉烯酶是这类细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。最近发现的NDM是目前水解谱最广,水解功能最强的一类碳青霉烯酶。通常携带NDM的菌株不但对碳青霉烯及其他的β内酰胺类抗生素耐药,也表现出耐喹诺酮,氨基糖苷等其他类抗生素的特性。这类携带NDM基因的菌株通过基因间水平传播,已经引起了全球范围内的播散。 人体肠道通常是各种耐药细菌和耐药基因的储存场所及感染来源。因此粪便标本培养作为一种理想的筛查方法,被美国疾病预防控制中心推荐用来检测耐碳青霉烯革兰阴性杆菌的携带者以便及时采取控制感染的措施。Ⅰ类整合子是一种广泛存在于细菌基因组中的可移动耐药元件,通过捕获耐药基因盒而导致细菌耐药性迅速产生及扩散。对于所携带基因盒类型的研究有助于阐明与其相关的耐药性。对粪便中携带的耐碳青霉烯革兰阴性杆菌耐药机制的研究有助于阐明抗生素耐药的分子机理以及耐药基因的传播方式,为更好的防治提供信息。 本研究对入院患者进行粪便中的耐碳青霉烯的革兰阴性杆菌筛查。对筛选出的NDM基因阳性菌株进行属种鉴定,药敏试验,Ⅰ类整合子及其基因盒进行检测并进行基因分型分析,研究粪便中携带产NDM超级细菌的特征,进一步阐述超级细菌的多药耐药机制。针对临床常见碳青霉烯酶基因NDM、KPC、IMP和VIM,本研究建立了一种能够进行快速、简便、敏感、特异的完成检测的LAMP方法。 研究方法 1.标本收集收集南方医院2013年7月至12月之间住院患者粪便标本5000份。在含2mg/l美罗培南麦康凯平板上培养分离耐碳青霉烯的革兰阴性杆菌。并进行分纯、转种和保存,用试剂盒提取细菌全基因组DNA。 2.产NDM超级细菌的检测从粪便中分离的细菌其基因组DNA利用常规PCR检测NDM基因,将阳性PCR产物进行测序验证并确定其亚型。 3.菌株属种鉴定及药敏试验NDM基因阳性的革兰阴性杆菌利用BDphoenix100进行属种鉴定和药敏试验。并同时用K-B法对亚胺培南和美罗培南的药敏结果加以确认。 4.16S rRNA基因测序利用标准菌株和临床常见菌株建立16S rRNA基因测序进行细菌鉴定的方法。对NDM基因阳性的菌株扩增并测序16S rRNA基因,经过序列分析进行其属种的确认,并与BD phoenix100的鉴定结果进行比较。 5. Ⅰ类整合子及其基因盒检测先利用PCR扩增Ⅰ类整合子的保守区整合酶1基因,再对阳性菌株进一步扩增Ⅰ类整合子的可变区。根据限制性内切酶Hinf和RsaI酶切可变区的图谱对不同菌株的可变区初步分类,同一属种不同的酶切谱型挑选2株进行可变区测序,分析序列的同源性得出各可变区的耐药基因盒组合。 6. ERIC-PCR产NDM超级细菌株中,对于重复出现的同一种属的细菌,进行ERIC-PCR基因分型,研究其分子流行病学特征。 7. NDM、KPC、IMP及VIM基因LAMP检测方法的建立通过各基因相应的常见亚型序列的比较,根据这四种常见基因家族的相对保守区设计LAMP引物。以本研究经过普通PCR及测序验证的含有相应基因的临床菌株为阳性对照,以无菌去离子水为阴性对照,建立定性的LAMP检测方法,可采用实时荧光和直接显色两种检测方法。用活菌计数法定量阳性对照菌株后,进行一系列10倍稀释,使最终于反应管中的DNA含量依次相当于105、104、103、102、10、1CFU的菌株。用此浓度系列的菌株DNA进行反应体系的敏感性评价。利用不含目的基因的大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黄色葡萄球菌ATCC25923进行反应体系的特异性评价。利用222株临床分离的耐碳青霉烯革兰阴性杆菌(100株不动杆菌,100株铜绿假单胞菌,22株肠杆菌科细菌)进行反应体系的临床菌株检测评价。在进行相关评价时均以普通PCR及电泳检测为相应的对照。 研究结果 1.产NDM超级细菌的分离在5000例粪便中共检出389株碳青霉烯耐药革兰阴性杆菌,其中96株为NDM基因阳性,经测序证实均为NDM-1亚型。 2.产NDM超级细菌的属种分布16S rRNA基因测序结果中与BD phoenix100鉴定结果基本一致,但有40株菌被后者误鉴定为粪产碱杆菌。这40株菌经16S rRNA序列分析为39株不动杆菌和1株Cupriavidus gilardii. BD phoenix100全自动微生物鉴定系统将某些不动杆菌鉴定为粪产碱杆菌的情况与其他报道一致。这96株产NDM超级细菌中非发酵菌占主导,包括68株不动杆菌、2株恶臭假单胞菌、1株铜绿假单胞菌、1株产碱杆菌和1株C. gi