木果楝属植物内生真菌的相关研究及苦参SfFPT基因植物双元表达载体的构建

作     者：李宁 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：戴均贵

授予年度：2013年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 0710[理学-生物学] 1006[医学-中西医结合] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：木果楝属 内生真菌 分离鉴定 抗肿瘤活性 化学成分 异戊烯基转移酶 植物双元表达载体 农杆菌 转基因烟草 

摘      要：第一部分木果楝可培养内生真菌的多样性及体外抗肿瘤活性 近年来,有关红树林内生真菌的活性次级代谢产物的研究显著增多,红树林内生真菌因其独特的生长环境往往具有独特的代谢途径和遗传背景,其次级代谢产物的种类和化学类型多样性也较为丰富。 本研究以采自海南三亚和泰国南部董里府（Trang Province）海岸的木果楝属植物（Xylocarpus）的枝、叶、果皮为材料,通过分离培养的方法从海洋红树林植物—木果楝属植物中分离培养相关真菌,运用分子生物学rDNA-ITS序列分析技术对其进行了分离和初步鉴定,并采用MTT法对菌液乙酸乙酯提取物进行初步体外抗肿瘤活性评价。 从3种红树林木果楝属植物中共分离得到百余株内生真菌单菌落,根据菌株的形态特征,包括菌落外观形态、大小、颜色、质地、生长速度、生长培养基颜色等特征初步去重,挑选了51株内生真菌单菌落进行分子生物学鉴定,结果发现它们分属于为子囊菌门3纲9目11科15属26种及担子菌门1种。实验观察到内生真菌在木果楝属植物的叶、枝以及果皮中广泛分布,在种属水平上呈现多样性;不同产地、不同种属植物分离得到的内生真菌在种属组成和数量上存在差异,其中拟茎点霉属Phomopsis、炭疽病菌属Colletotrichum在三种木果楝属植物中均分离得到,拟茎点霉属Phomopsis、炭疽病菌属Colletotrichum为木果楝属植物可培养内生真菌的优势菌属。 16种菌株菌液乙酸乙酯提取物表现出良好的体外抗肿瘤活性。曲霉属Aspergillus terreus葡萄座腔菌属Botryosphaeria、赤霉属Gibberella青霉属Penicillium等菌株代谢产物对人结肠癌细胞HCT-116、人肝癌细胞Bel-7402、人胃癌细胞BGC823、人肺癌细胞A549和人卵巢癌细胞A2780（SK-OV-3）五种肿瘤细胞增殖生长均有良好的抑制作用。多株拟茎点霉属Phomopsis的菌液乙酸乙酯提取物对人结肠癌细胞HCT-116、人胃癌细胞BGC823有良好的选择性抑制活性。这些结果为下一步活性菌株的挑选和代谢产物的分离提供了依据。 选择有良好的体外抑肿瘤活性的菌株Trichoderma sp. Xy24（0106）进行放大发酵培养,并对其代谢产物进行初步分离,得到3个化合物,经多种波谱学方法鉴定了其中一个化合物为Trichodimerol。 上述研究一方面可为探究木果楝植物与其内生真菌之间的关系奠定基础,另一方面可通过对具有良好药理活性菌株的次级代谢产物进行系统分析分离以寻找具有新颖结构的先导化合物,用于创新药物研究。 第二部分苦参SfFPT基因植物双元表达载体的构建 黄酮类化合物具多种生物活性,如心血管活性,抗菌抗病毒活性,抗肿瘤活性等,黄酮类化合物的芳环发生异戊烯基取代后能增加其生物利用度、改善其生物活性,增加黄酮的结构多样性。 本实验室前期成功地对苦参中黄酮异戊烯基转移酶基因进行克隆,得到了sfFPT基因,并于在酵母真核表达系统中进行表达及功能鉴定,成功地利用工程菌特异性催化多种黄酮类化合物的异戊烯基化。本研究的目的是通过构建植物双元表达载体,将黄酮异戊烯基转移酶基因SfFPT转化到烟草中,展开SfFPT基因在植物中表达与催化功能研究,取得了如下结果： （1）通过设计引物将SfFPT基因正向插入载体的CaMv35S启动子和NOS终止子之间,构建重组植物双元表达载体,***05一Sf-NR、pC02-Sf-GFP。 （2）将相应重组表达载体分别导入到发根农杆菌K599和根癌农杆菌LBA4404中。 （3）用根癌农杆菌LBA4404-p02sf-gfp.K599-p02sf-gfp浸染烟草,尝试转基因烟草的培育,为下一步转基因烟草培育、筛选和异戊烯基转移酶基因在烟草中的表达打下了基础。