抑胶素对大鼠C6胶质瘤细胞抑制作用的体内实验研究
作者单位：吉林大学
学位级别：硕士
导师姓名：马涤辉
授予年度：2004年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
摘 要：神经胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，是颅内肿瘤中最常见的一种。因其侵袭性生长的特性，手术难以完全切除，术后复发率高，至今术后化疗仍是很重要的方法。目前，胶质瘤的常规化疗药物，易导致中枢神经系统甚至全身的毒副作用，且不能有效通过血脑屏障，使它们的应用受到限制，故寻求一种高效低毒、特异性高、不易发生耐药的抗胶质瘤药物有重要意义。 抑胶素作为一种特异性氯离子通道阻滞剂，是一种蝎毒素多肽，其有效成分是氯毒素（Chlorotoxin）。它能特异性与胶质瘤细胞表面的氯离子通道结合，进而杀死瘤细胞，所以氯毒素作为人体神经胶质瘤选择性靶向新药有着巨大的应用前景。 目的：研究氯通道阻滞剂抑胶素对大鼠脑胶质瘤模型的抑瘤效应及肿瘤细胞增殖活性变化。 方法： 1、对C6胶质瘤细胞株进行了复苏、培养后，用GFAP免疫组化染色鉴定细胞的来源，于接种前采用MTT法测定细胞存活率达90%以上。 2、采用脑立体定向术，在Wistar大鼠脑尾状核接种C6细胞，饲养7天后，观察大鼠的生存状态，并采用病理学检查等方法证实成功地建立了动物模型。 3、在动物模型的基础上，于接种后一周随机将大鼠分为实验组（分 为抑胶素不同药物浓度组和顺铂组）及空白对照组，给药7天后观察肿瘤体积变化，计算抑瘤率;并采用HE染色、光镜、电镜等方法，对比观察分析抑胶素及顺铂对鼠脑胶质瘤作用的形态学变化。 4、应用免疫组织化学方法检测应用抑胶素前后鼠脑胶质瘤PCNA蛋白表达，探讨其对肿瘤细胞增殖活性的影响。 结果： 1、实验组大鼠有较好的生存状态,而对照组状态不佳，死亡较多，死亡率达20％。 2、抑胶素对C6鼠脑胶质瘤的生长具有明显的抑制作用。浓度为16～64ug/kg均有一定地抑瘤作用，以后两者的抑瘤作用较强，肿瘤体积较对照组明显缩小，抑瘤率分别达38.3%和54.61%，这与体外实验结果基本一致。 3、光镜下观察，对照组的瘤细胞生长活跃密集成群，向脑组织浸润生长。瘤细胞异型性明显，体积大，胞质红染，细胞核大深染，核分裂像多见，少数细胞可见核固缩、浓染。实验组Ⅰ给药后，镜下表现与对照组无明显差别;实验组Ⅱ镜下瘤细胞丰富密集，多形性明显，可见核分裂象，凋亡细胞易见，常见坏死区和出血灶，血管增生丰富;实验组Ⅲ可见瘤细胞较为稀疏，可见大量的凋亡细胞，核分裂象较少见，亦可见坏死的细胞，膜不完整，胞核很淡甚或消失，周边可见出血灶;实验组Ⅳ在光镜下可见到瘤细胞数量明显减少，肿瘤细胞坏死，胞浆溶解，仅剩核碎片堆集在一起，坏死或凋亡后的肿瘤细胞被增生的胶原纤维细胞所替代; 顺铂组显示瘤细胞呈典型的凋亡改变。 4、透射电子显微镜观察给药前后瘤细胞的超微结构变化：对照组细胞形态不规则，突触发达，细胞表面可见微绒毛结构，细胞核亦不规整，核内异染质较多，细胞质内可见到线粒体、粗面内质网及游离核糖体等结构。抑胶素实验组及顺铂组细胞突触减少，微绒毛消失，细胞核极不规则，核固缩明显，可见细胞核有切迹，细胞质内多数线粒体肿胀、空化，线粒体嵴断裂，内质网扩张，同时有一些髓样小体出现，顺铂组瘤细胞呈典型的凋亡形态特征。 5、PCNA免疫组化结果分析：PCNA阳性细胞的胞核呈黄色或棕黄色，对照组肿瘤细胞明显表达PCNA，表现为阳性细胞密度高，胞核呈强阳性;经抑胶素治疗后即可见肿瘤内PCNA阳性细胞密度下降，核PCNA阳性强度减弱，随浓度增高阳性率呈下降趋势。 结论： 本实验采用光镜、电子显微镜方法观察了在一定时间内应用不同浓度抑胶素前后胶质瘤细胞的变化，结果显示，在正常情况下，胶质瘤细胞即有轻度的凋亡及坏死，而给予抑胶素治疗后，显示典型的凋亡细胞形态学特征，细胞固缩，染色质浓缩、边集等;同时证实抑胶素使肿瘤体积缩小，抑瘤率增加;应用免疫组化法检测PCNA表达，显示经抑胶素治疗后即可见肿瘤内PCNA阳性细胞密度下降，核PCNA阳性强度减弱，且随浓度增高阳性率呈下降趋势。以上研究结果证实了抑胶素能够抑制体内C6胶质瘤细胞的生长，其作用机制可能与诱导脑胶质瘤细胞发生凋亡及抑制肿瘤细胞增殖有关。
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