文心兰OnEIN2的基因特性与CRISPR/Cas9介导的基因编辑研究

作     者：时欢 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄鹏林;赖钟雄;叶炜

授予年度：2018年

学科分类：090706[农学-园林植物与观赏园艺] 0907[农学-林学] 09[农学] 

主      题：文心兰 EIN2 乙烯信号传导 CRISPR/Cas9 遗传转化 

摘      要：文心兰（Oncidesa）是兰科（Orchidaceae）文心兰属植物,是世界上重要的盆花和鲜切花种类之一,具有较高的经济价值。在鲜切花的生产和运输中造成的机械损伤而产生的乙烯易使其花瓣衰老较快。这是制约其更广泛的应用的一大因素,至今只能通过一些药剂等手段暂缓其花瓣的衰老,还未从源头上得到解决,因此选育乙烯不敏感型的文心兰品种是文心兰育种的一大重要方向。乙烯不敏感蛋白（ethylene-insensitive 2,EIN2）作为乙烯信号转导过程中的关键枢纽,对乙烯反应机制的完成有着重要影响。现已证实EIN2基因突变时可以实现乙烯不敏感,阻断乙烯信号的传导过程,从而使乙烯反应不能完成。本研究以文心兰’南茜’为材料,利用兰花转录组数据,通过RT-PCR以及RACE技术克隆获得EIN2基因,并通过实时荧光定量PCR以及转化文心兰原球茎、愈伤组织、原生质体的研究,对该基因进行初步的功能验证。本文研究的主要结果如下:1文心兰OnEIN2基因的克隆与生物信息学分析本研究基于AtEIN2的核酸序列作为参考,与南茜转录组数据库进行比对分析,获得一条相似度较高的cDNA序列。设计引物利用RT-PCR结合RACE技术克隆得到文心兰EIN2基因,它的cDNA的长度为4 177 bp,ORF全长3 876 bp,编码1292个氨基酸,命名为OnEIN2（GenBank登录号为MH497388）。生物信息学分析表明:文心兰EIN2含有典型的Nramp家族,是一种跨膜蛋白。系统进化树分析了 22种不同物种EIN2基因的氨基酸序列,其中可以分为两类,其中Ⅰ类除了香石竹外均是单子叶植物,而文心兰是单子叶植物属于Ⅰ类,符合物种进化规律。2激素和非生物胁迫处理下文心兰OnEIN2基因表达模式分析以文心兰’南茜’健康植株为材料,利用实时荧光定量PCR检测OnEIN2基因在文心兰的根、假鳞茎、叶和花中均有表达。其中OnEIN2在花中的表达量最高,远远大于其他三个组织部位,说明该基因在花的整个发育过程中起重要作用;而在不同花期中的表达量结果显示其在盛花期相对表达量最高,而后是衰老期,而花苞期、绽口期和半开放期的表达量相似。其表达量的差异及其时空表达特异性表达说明它与花的衰老有很大关系。通过对文心兰’南茜’健康植株进行不同的激素和非生物胁迫处理,发现OnEI 对 IAA、GA、ABA、6-BA、SA、MeJA、乙烯利、NaC1 以及 PEG 均有响应。在 IAA、GA、ABA、6-BA、SA、MeJA、NaC1以及PEG处理下OnEIN2整体而言都是下调表达,只有在乙烯利的处理下先上调表达,而后也变成下调。在ABA和PEG处理下的表达趋势较为相似,都是先下降后上升,再下降再上升。在6-BA、GA、SA、MeJA和NaC1处理下表达呈现先下降后上升再下降的趋势。在IAA处理下表现出下降上升再下降上升再下降的趋势。无论是外源激素还是非生物胁迫均影响着OnEIN2的表达量,推测这种结果是各种激素或多或少通过对乙烯的合成及信号转导过程的影响造成的。3利用CRISPR/Cas9编辑文心兰EIN2基因的研究以文心兰健康植株的叶片和侧芽为材料分别分离文心兰原生质体和诱导发愈伤组织,获得了良好的受体转化材料。构建OnEIN2的CRISPR/Cas9载体,并分别利用PEG法和农杆菌介导法转入文心兰原生质体、原球茎和愈伤组织等。对转基因材料进行GUS和Cas9的检测,检测目的载体的转化结果。通过HRM检测是否有碱基的突变,同时对转基因后的材料进行OnEIN2的qPCR分析。试验结果表明:通过GUS和Cas9的检测,大部分文心兰组织材料为阳性转基因。进行HRM的分析表明大部分文心兰组织材料有碱基突变的发生。但相较与原球茎和愈伤组织而言,转基因的原生质体的碱基突变较少。qPCR的结果表明转基因后的文心兰OnEIN2的表达量有所下降。种种检测结果说明CRISPR/Cas9载体对OnEIN2编辑有效果,使其产生了碱基突变,一定程度上也使其表达量下降。推测是碱基突变导致该基因的表达有所差异。