定向迁移细胞前沿Rac局部化激活的分子调控机制

作     者：李友军 

作者单位：湖南师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭向荣

授予年度：2012年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：Paxillin-GIT1-PIX-PAK信号转导通路 Rac蛋白激活 免疫印迹 荧光双定位 

摘      要：根据激活的整合素α4在细胞尾部、两侧,负调控Rac活性的信号转导通路的研究结果,结合相关信号分子的结构、功能,提出了在细胞前沿,整合素正调控Rac活性的信号转导通路,即当α4胞内区域磷酸化而抑制其与Paxillin结合时,Paxillin、GIT1,与PIX、PAK形成信号分子复合物。由于PIX为Rac的转换分子,PAK为Rac的效应分子,构成了Paxillin-GIT1-PIX-PAK信号转导通路,从而促使Rac在细胞前沿持续的局部化激活,导致片状足的形成,产生细胞向前扩展推动力的全新构想。本文利用蛋白免疫印迹法,将种植于纤粘蛋白(fibronectin)包被的培养皿中的CHO细胞(Chinese hamster ovary)裂解,在蛋白A/G琼脂糖珠(protein A/G agrose beads)的作用下,以抗Paxillin、PIX的单克隆抗体与细胞裂解液免疫共沉淀。SDS-PAGE分离蛋白,转膜,用化学发光(Super-Signal West Pico detection Kit, Pierce)以抗GIT1的单抗在分子成像系统(ChemiDocTM XRS,BIO-RAD)上直接检测,验证了Paxillin?PIX与GIT1蛋白两两之间具有相互作用。并通过荧光双定位证实了Paxillin与GIT1, GIT1与PIX的相互作用可以定位于细胞前沿,即证实了Paxillin-GIT1-PIX可以三元复合体形式存在于细胞前沿。Rac蛋白激活试验表明,在纤粘蛋白(fibronectin)刺激下,整合素a4聚集成簇,激活Paxillin-GIT1-PIX-PAK的信号转导通路,使Rac蛋白处于激活状态(GTP-bound)。本文的实验结果清晰地表明,GIT1与Paxillin、PIX在活细胞中均存在强烈的相互作用,且这种相互作用可发生在细胞前沿。由于Rac的转换因子PIX(PAK-interacting exchange factor)在活细胞中往往与PAK相伴而行,因而,在细胞前沿,必定存在Paxillin-GIT1-PIX-PAK的信号转导通路。在纤粘蛋白(fibronectin)刺激下,整合素α4诱导Rac蛋白处于激活状态(GTP-bound)。该试验结果为定向迁移细胞前沿Rac局部化激活的分子调控机制的研究奠定了实验基础。