草珊瑚叶片cDNA文库构建及EST分析

作     者：谢德金 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郑郁善

授予年度：2016年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 10[医学] 

主      题：草珊瑚 RNA提取 cDNA文库 EST分析 功能注释 

摘      要：草珊瑚Sarcandra glabra (Thunb.)Nakai是金栗兰科草珊瑚属(Sarcandra)常绿半灌木,是一种传统的中草药。本研究从草珊瑚的本草考证、生物学特征、资源概述、化学成分、药理作用及草珊瑚研究现状这6个方面进行了综述。草珊瑚的研究多集中于栽培技术、化学成分、质量控制、种质资源遗传多样性等方面,而对于深层次的分子克隆、代谢途径及蛋白功能的研究鲜有报道,有待于进一步探究。本研究以适宜的草珊瑚叶片总RNA提取方法为基础,构建了草珊瑚叶片的cDNA文库并进行了初步的生物信息学分析。主要研究内容和结果如下：1、本研究用CTAB法、CTAB-Trizol法、Trizol法、CTAB-LiCl法、天根RNA提取试剂盒法、百泰克RNA提取试剂盒法共6种方法提取草珊瑚叶片的总RNA。研究结果表明：采用天根试剂盒快速提取草珊瑚叶片总RNA,提取的总RNA能达到试验要求;同时CTAB-LiCl也是一种选择,只是时间较长、过程相对繁琐,其它4种方法不适合提取草珊瑚叶片总RNA。2、将提取的符合要求的草珊瑚叶片总RNA进行cDNA文库的构建,在合成cDNA的过程中,对ds cDNA的起始材料、最优循环数和载体连接比例进行了优化。分别确定了ds cDNA合成的起始材料是第一链原液2μL,第18循环为最优循环,载体与cDNA的最佳连接比例是1：1.98,文库滴度为1.14×107 cfu·mL 1,检测到插入的片段大小在500～3000bp之间,平均约1000bp,扩增后的文库平均滴度是0.94×108 cfu ·mL-1。3、经测序共得到177个有效的EST序列,GC的含量为41.9%,平均长度790bp;对177条序列进行拼接与聚类,共得到151条单一序列(unigene),其包含有12个片段重叠群(contig)及139个单基因(singleton),文库的冗余度为14.7%。草珊瑚叶片中低丰度表达的基因有139条(92.05%)：中丰度表达的基因有10条(6.62%);高丰度表达基因有2条(1.32%)。对151条单一序列进行同源性分析和序列比对。有32条(21%)无同源性,是新序列;119条(79%)有同源性,包括24条已知功能的蛋白和91条的预测蛋白,而未知蛋白有4条(3%)。5、用Blast2GO、KEGG软件进行相关基因功能注释和代谢通路分析。119条unigenes在blasOGO共获得了415个GO terms,并且将其归结为3类：生物学过程(Biological Process)、分子功能(Molecular Function)、细胞组件(Cellular Component)。生物学过程共185个GO terms,占44.85%;分子功能有104个GO terms,占25.06%;细胞组件则有126个GO terms,占30.36%。共获得具有KEGG注释的序列有50条。获得KEGG注释的50条序列根据BRITE功能等级分类,共统计出：有29条序列信息与代谢相关,有19条序列与遗传信息加工有关,有10条序列属于环境信息加工方面的内容,有11条是参与细胞过程的序列,有25条相关序列信息属于生物体系统的范畴,而属于人类疾病相关的序列信息有32条,共126条。6、物种相似性分析方面,草珊瑚叶片与莲花的相似性最高,但并没有检测到与同属植物的相似性,说明本属植物基因组、转录组及蛋白组方面的研究较少。