RNA干扰建立MMP-9基因稳定沉默的胃癌细胞株BGC823

作     者：刘凯华 

作者单位：福建医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蔡建春

授予年度：2007年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胃腺癌细胞株 基质金属蛋白酶-9 RNA干扰 浸润 转移 

摘      要：肿瘤细胞和内皮细胞穿过基底膜和细胞外基质的迁移过程需要一系列蛋白水解酶的参与。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)作为明胶酶的一种,能降解基底膜和细胞外基质成分,从而促进肿瘤的浸润、转移及间质血管新生,因此受到了越来越多的重视。RNAi技术的快速发展和日益成熟,为我们提供了研究肿瘤的新方法。本文重点研究胃癌细胞中MMP-9的表达情况,建立了有效的MMP-9基因沉默的BGC823细胞株,为进一步的体内体外侵袭实验奠定基础。 研究发现,BGC823表达MMP-9相对较多,主要表达于胞浆中,胞膜上也有颗粒状表达,培养基中有较高活性的MMP-9,能够消化明胶,提示肿瘤细胞可以通过向外周分泌MMP-9降解细胞外基质,以利肿瘤细胞的浸润、转移。 研究采用pGenesil载体介导的干扰系统,通过脂质体转染入低分化胃腺癌细胞BGC823。实验对BGC823细胞的转染条件进行摸索,通过对细胞密度、质粒和脂质体用量及比例的优化,确定在转染前24小时铺板细胞数为1×10、pGenesil用量为1.2μg、Sofast用量1μl时(24孔板),于转染后48小时可达到最高转染效率,约30%。将达到最佳转染效率的细胞以500μg/ml浓度的G418进行克隆筛选,得到超过90%的转染效率,从而可以对RNAi抑制MMP-9基因表达效果进行进一步检测。5个月后观察绿色荧光标记仍有表达,可见该载体介导的RNA干扰效果非常持久。 siRNA的基因沉默效应具有选择性,所以本实验由专业公司设计了3条针对不同MMP-9靶序列的短发夹结构RNA(short hairpin, shRNA)并构建到pGenesil质粒上,通过在mRNA和蛋白质水平及酶活性检测干扰和未干扰的细胞MMP-9的表达,发现转染后3条shRNA都可以使MMP-9的mRNA和蛋白表达下降,而基因沉默效果却不相同,MMP-9的效果最好。选择MMP-9进行稳定转染和筛选,从而构建BGC823的MMP-9基因沉默模型。 本研究尝试在胃癌细胞中对MMP-9基因通过RNA干扰进行沉默,首次构建了MMP-9基因沉默的BGC823细胞株。在实验中,获得较高的转染效率和干扰效果非常重要。本研究获得了满意的转染效率的细胞克隆,寻找到干扰效果较好的shRNA。该基因沉默细胞株的建立,为体内外胃癌浸润、转移实验奠定了基础。