TSA对人肝癌细胞株E-cadherin启动子区甲基化及表达的影响

作     者：郭广成 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王家祥;范正军

授予年度：2009年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：癌 肝细胞 曲古抑菌素A 上皮型钙粘素 DNA甲基转移酶3b 

摘      要：背景及目的 肝癌是人体常见的致命性肿瘤,预后差,严重威胁人类健康,因此深入研究肝癌的发生发展机制,进而加强肝癌的防治具有重要意义。 随着医学科学的发展,目前已认识到,肿瘤的发生是一个涉及多种基因功能改变的多步骤过程,尽管非遗传因素在这一过程中也起作用甚至是重要作用,但其核心作用是肿瘤抑制基因(抑癌基因)的失活和癌基因的活化,从而使突变细胞获得选择性生长优势、克隆扩增,最终恶变为癌症。 以往对抑癌基因的研究主要聚焦于基因突变、基因删除等遗传缺陷(geneticdefect)方面,近年来逐渐认识到表遗传学(epigenetics)调节与抑癌基因的转录调控密切相关。研究表明,表遗传学改变可引起抑癌基因的功能改变,进而导致肿瘤的发生。 DNA甲基化是基因表遗传学调节的重要方式之一。DNA甲基化是指DNA分子上CpG双核苷中的胞嘧啶(cytosine)处于甲基化状态。DNA的甲基化是在DNA甲基转移酶的催化作用下完成的,而DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)是DNA甲基转移酶家族中重要的一员,主要作用于双链均未被甲基化的DNA。DNA甲基化可影响诸多方面,包括印记基因的调节、肿瘤抑制基因沉默、X染色体失活等。研究表明,正常不被甲基化的CpG岛在肿瘤组织中却被甲基化,并发现启动子区的甲基化可影响基因的转录活性,与基因的转录沉默有关,并且在多种肿瘤中存在着DNMTs的高表达以及肿瘤抑制基因的转录失活。由此推测DNA甲基化以及DNMTs的表达改变可能与肿瘤的发生发展有关。 肿瘤时组蛋白修饰异常是一个正在积极研究的课题,尤其是组蛋白乙酰化与去乙酰化异常的研究最多。组蛋白乙酰化/去乙酰化主要由组蛋白乙酰化酶(histone acetylases,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)催化完成。HATs和HDACs之间的动态平衡控制着染色质的结构和基因的表达,它们的功能紊乱是肿瘤发生发展的重要分子机制之一。组蛋白乙酰化/去乙酰化是可逆的动态过程,可逆性的组蛋白乙酰化平衡对维持染色质结构和调节基因表达有着至关重要的作用。许多研究已证实组蛋白高/低乙酰化在肿瘤发生中发挥重要作用。 曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)是链霉菌代谢产物,为组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACI)的代表药物之一。有研究表明TSA在纳摩尔级浓度就能有效抑制肿瘤细胞增殖,刘维民等研究发现TSA在纳摩尔级浓度即可明显抑制肝癌SMMC-7721细胞的生长并诱导其发生凋亡。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)具有的锌指结构与组蛋白乙酰化赖氨酸残基侧链结构相似,可以竞争性抑制组蛋白去乙酰化酶的活性而提高组蛋白乙酰化水平,改变染色质结构,从而达到调控特定基因转录与表达水平的作用,其主要生物学效应包括诱导肿瘤细胞分化、细胞周期阻滞和细胞凋亡。 E-cad基因(E—cadherin,上皮型钙粘素)位于16q22.1上,表达的E-cad蛋白是一种分子量为120KDa的跨膜糖蛋白,它分布于同种上皮细胞侧面的中间连接处,是中间连接介导细胞连接的分子基础。E-cad广泛分布在胚胎和成熟组织上皮细胞中,在调节胚胎发育、组织形成、维持组织结构完整性、参与细胞与细胞信息传递并在细胞粘附中起着至关重要的作用。在人类上皮性恶性肿瘤中,E-cad基因的表达也受到启动子区CpG岛甲基化的调节。大多数研究认为E-cad基因的失表达与基因CDH1启动子区CpG岛高甲基化有关。 有研究显示组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂可以逆转某些抑癌基因的失表达,进而抑制包括肝癌在内的多种肿瘤细胞的生长。有文献报道组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理膀胱癌细胞株能恢复因启动子区CpG岛高甲基化而失活的E-cad基因的表达。本实验用TSA处理人肝癌SMMC-7721细胞株,观察该细胞株E-cad基因启动子区CpG岛甲基化状态及其表达水平改变,及这种效应与DNMT3b表达的关系,探讨TSA导致的组蛋白乙酰化与DNA甲基化的关系及其可能机制。 方法 1.传代培养人肝癌SMMC-7721细胞株。 2.不同浓度的TSA处理肝癌SMMC-7721细胞株,观察不同时间细胞生长情况。 3.选取合适浓度TSA处理肝癌SMMC-7721细胞株,收集试验组和对照组细胞,并提取总蛋白和基因组DNA。 4.分别用Western blot和MS-PCR(甲基化特异性PCR)技术检测两组细胞中DNMT3b和E-cad的表达改变以及E-cad基因启动子区的甲基化状况。 5.处理数据,得出结论。 结果 ***法检测细胞生长曲线,计算抑制率 300nm/L的