PD-L1抗体纳米颗粒的制备及其对肺癌治疗作用的研究
作者单位：鲁东大学
学位级别：硕士
导师姓名：王晓洁
授予年度：2018年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
摘 要：当今世界,肺癌是一种非常多发的恶性肿瘤,也是我国城镇人口死亡的主要肿瘤之一。化疗作为近现代治疗癌症的主要方式,虽然应用广泛但这种治疗方式可能会对患者的身体造成诸多的毒副作用。近年来靶向治疗进展迅速,但寻找合适的靶点,仍是目前靶向治疗格外关注的问题。有很多研究表明肿瘤细胞通过持续高表达PD-L1即程序性死亡分子1配体(programmed death 1 ligand)能够发生免疫逃逸现象。因此,PD-L1是肿瘤诊疗中的热点,并有着重要的临床意义。利用聚合物纳米技术输送药物已经表明对改善癌症治疗有很大的帮助。脂质体有高度生物相容性,能够与各种各样的分子相互作用,并且脂质体表面容易地官能化易于连接各种靶向分子。将两者结合并进一步将靶向分子连接至颗粒表面能使其能够在肿瘤部位更好地积累。应用小动物成像的方法可以在纳米颗粒中包裹荧光染料并从活体水平上观察靶向及治疗效果。本实验利用脂质体和聚合物纳米颗粒两者的优点,合成载盐酸阿霉素脂质体-聚合物纳米颗粒(简称纳米颗粒),并将其与PD-L1抗体偶联(简称PD-L1抗体纳米颗粒)。纳米颗粒中包入盐酸阿霉素及近红外染料DIR,并在动物实验运用小动物成像方法,对靶向及治疗作用进行了评估。重要实验结果如下:1、PD-L1抗体纳米颗粒的制备:采用双乳化法合成包裹抗肿瘤水溶性药物盐酸阿霉素及近红外脂溶性染料DIR的PEG-PLGA纳米颗粒,合成保留上清液。盐酸阿霉素包裹在纳米颗粒中心核的亲水层中,DIR染料在PLGA层中。再用薄膜分散法在聚合物纳米颗粒表面包裹一层脂质体,再在脂质体表面连接PD-L1抗体靶向分子。合成外观呈粉红色胶体状粒径在100-200nm纳米颗粒。2、表征测定和包封率,载药量计算:采用粒度电位仪来测定PD-L1抗体纳米颗粒的粒径,结果显示合成的粒径在100-200nm,表明所合成纳米颗粒具有良好的稳定性;透射电子显微镜观察其形态,结果显示所合成的颗粒呈球状,能够明显的看出脂质体膜和纳米材料的分层,直径在100-200nm;用透析法进行纳米颗粒的体外释放实验,结果发现纳米颗粒有一定的缓释能力;稀释不同浓度的盐酸阿霉素溶液建立阿霉素紫外吸收标准曲线,测定保留上清液的吸光度来确定包裹的盐酸阿霉素含量再根据标准曲线确定质量来测定包封率和载药量。计算结果纳米颗粒的包封率为60.24%左右,载药量约为5.62%。3、体外细胞实验:MTS实验检测细胞毒性,不同浓度的非载药纳米颗粒与A549肺癌细胞共培养24h,不同盐酸阿霉素浓度的游离药物与PD-L1抗体纳米颗粒分别和细胞孵育24h。结果显示,非载药纳米颗粒细胞存活率和正常组(阿霉素0mg/mL)没有显著差异,随浓度增加也没有显著差异,PD-L1抗体纳米颗粒组与游离药物组比较,在盐酸阿霉素浓度为20μg/mL和10μg/mL时,PD-L1抗体纳米颗粒组细胞存活率显著低于游离药物组(P0.05),说明PD-L1抗体纳米颗粒能够更好的携带药物进入肿瘤细胞进行杀伤;细胞流式实验探究细胞摄取,不同盐酸阿霉素浓度的纳米颗粒与PD-L1抗体纳米颗粒和细胞共孵育4h。结果表明,在浓度20μg/mL和10μg/mL时PD-L1抗体纳米颗粒组细胞荧光强度显著强于纳米颗粒组(P0.05);共聚焦显微镜观察纳米颗粒入胞情况,共聚焦培养皿中游离盐酸阿霉素和纳米颗粒分别与A549细胞共孵育2h、4h,结果显示,盐酸阿霉素的红色荧光进入了细胞内,PD-L1抗体纳米颗粒4h组细胞内红色荧光比2h组强,PD-L1抗体纳米颗粒4h组胞内红色荧光比游离阿霉素4h组强。流式和共聚焦实验表明了A549细胞对PD-L1抗体纳米颗粒摄取比较多。4、体内靶向实验:A549肺癌细胞建立裸鼠皮下瘤模型,尾静脉分别注射纳米颗粒和PD-L1抗体纳米颗粒,小动物活体成像系统分别在注射前、注射后1h、4h、12h、24h等时间点观察拍照。结果显示,PD-L1抗体纳米颗粒组在肿瘤处的荧光强度明显强于纳米颗粒组,且肿瘤轮廓清楚,随着时间推移荧光强度也越来越强,说明靶向PD-L1抗体纳米颗粒具有一定的靶向能力。体内治疗实验:用能够表达荧光素酶的A549-luc肺癌细胞建立裸鼠皮下瘤模型,分成三组每组5只,分别尾静脉注射PBS、阿霉素、PD-L1抗体纳米颗粒,第0、2、4d,3次给药,给予4mg/kg的剂量(以盐酸阿霉素的量计)。每隔两天记录老鼠体重及测量肿瘤大小,每隔2天拍摄自发荧光图像,连续四周。实验结果显示,第4周最后观察时,PD-L1抗体纳米颗粒组的肿瘤体积显著小于游离阿霉素组与PBS对照组(P0.05),游离阿霉素组有明显差异小于PBS对照组(P0.05),说明PD-L1抗体纳米颗粒有更好的治疗效果。5、结论:本研究合成的PD-L1抗体纳米颗粒,是一种良好的靶向肺癌肿瘤细胞的药物载体,能够被A5
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