中国大鲵ERα、P450arom基因的克隆及不同发育期4种性别决定相关基因的表达分析
作者单位：陕西师范大学
学位级别：硕士
导师姓名：梁刚
授予年度：2016年
主 题：中国大鲵 性别决定相关基因 克隆 荧光实时定量PCR
摘 要：中国大鲵(Andrias davidianus)是我国特有的有尾两栖动物,也是全球现存两栖类中体型最大的古老物种,属于国家Ⅱ级重点保护野生动物,具有重要的经济、科研和生态价值。然而,近年来由于栖息地的破坏、过度捕杀以及传染病等因素,导致中国大鲵种群数量急剧下降。为了更好地保护这一古老物种,我国科研人员开始了中国大鲵的人工驯养繁殖研究,先后形成了中国大鲵全人工繁育(Captive Breeding)、原生态繁育(Natural Eco-breeding)、仿生态繁育(Imitated Natural Eco-breeding)等3种人工繁殖技术。随着人工繁育技术的突破,中国大鲵人工种群数量剧增。然而,在人工较高水温饲养条件下,幼鲵绝大部分发育成为雄性,造成中国大鲵人工种群性别比例严重失调。为了解决此问题,在幼鲵性腺分化的敏感期,使用一定浓度的外源雌二醇断续暴露40 d,又使得幼鲵已连续4年全部分化为雌性。以上现象表明,中国大鲵性腺分化受到环境水温与外源雌二醇的直接影响。本文在中国大鲵首次克隆了雌激素受体(estrogen receptor alpha, ERa)、细胞色素P450芳香化酶(cytochrome P450 aromatase, P450arom)的基因序列,并进一步检测分析了12、24、36月龄中国大鲵的ERa、P450arom、Sox9、Dmrt2等4种性别决定相关基因在肝、脑、性腺的表达变化,这不仅有助于了解有尾两栖类性腺分化的分子机制,而且也有助于更好地保护中国大鲵这一古老物种。ERa属于细胞核转录因子超家族成员之一,参与动物生长与繁殖等生命活动的调节。ERa通过与雌激素结合来启动雌激素应答原件,发挥雌激素的生物学效应。已有的研究表明,雌激素在脊椎动物的性腺分化、卵黄生成及维持正常生殖行为等方面发挥着重要作用,它的合成依赖于P450arom。在脊椎动物体内,P450arom催化睾酮和雄烯二酮转变为雌激素。Sox9基因在脊椎动物性别决定和性腺分化过程中起重要作用,是Sox基因家族的重要成员,该基因家族的共同特征是都含有一个可以编码约79个氨基酸的HMG保守区域。Dmrt2被认为是参与脊椎动物体节形成的重要基因,同时在性别决定和性腺分化过程中也具有重要作用,Dmrt2属于DMRT基因家族成员,该基因家族的共同结构特征是都含有一个保守的DM结构域。依据Genbank中已经公布的日本大鲵(A. japonicus)、欧非肋凸螈(Pleu rodeles waltl)、东京小鲵(Hynobius tokyoensis)、墨西哥钝口螈(Ambystomamexicanum)红腹蝾螈(Cynops pyrrhogaster)、滞育小鲵(Hynobius tokyoensis)等有尾两栖类的ERa和P450arom基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术,从7龄中国大鲵的卵巢克隆得到了ERa和P450arom基因的编码区序列,并进一步检测了二者在肝、脑、卵巢、肾、心、肺、肌肉、皮肤、小肠、眼球等10种器官中的表达模式(Tissue distribution pattern)。为了进一步探讨不同发育期中国大鲵ERa、P450arom、Sox9、Dmrt2基因的表达变化,还选取了12、24和36月龄的中国大鲵,对其头体长、尾长及体重等指标进行了统计学分析,还对其性腺进行了组织学观察比较,并通过荧光实时定量PCR检测了ERa、 P450arom、Sox9、Dmrt2基因在肝、脑、性腺的表达变化。主要结果与结论如下：1.中国大鲵ERa基因编码区全长为1755 bp,包括起始密码子ATG和终止密码子TGA,共编码584个氨基酸。ERa氨基酸序列相似性分析显示,脊椎动物不同物种之间在DNA结合域高度保守,其中两栖类ERa同源性高达80%以上,表明ERa在进化过程中较为保守。此外,中国大鲵ERa氨基酸序列的N末端缺失开始的MT,经过与其它已报道的有尾两栖类比对后显示,ERa氨基酸序列N末端缺失开始的MT是有尾两栖类的共同分子特征。2.中国大鲵P450arom基因编码区全长为1509 bp,包括起始密码子ATG和终止密码子TGA,共编码502个氨基酸。氨基酸序列分析显示,两栖类P450arom同源性高达75%以上,表明其在进化过程中也较为保守。3.为进一步探讨中国大鲵与其它物种之间的系统发生关系,基于ERa和P450arom氨基酸全序列,并运用MEGA5.0分别对不同物种的ERa和P450arom氨基酸全序列进行了邻接法(Neighbor-joining method)系统发育树的构建,模型为JTT model、Bootstrap method检验进化树,重复值1000。结果均显示,中国大鲵与有尾两栖类进化关系较近,其次是无尾两栖类,而
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