醋制降低京大戟肝毒性机制的初步研究

作     者：陈海鹰 

作者单位：南京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：丁安伟

授予年度：2013年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：京大戟 醋制 pekinenal 肝毒性 氧化损伤 

摘      要：京大戟(Euphorbia pekinens is Rupr.)是药用植物大戟的干燥根,始载于《神农本草经》,列为下品,临床上含京大戟的经典方剂有大戟散、十枣汤等,常用于肝硬化腹水、胸腔积液等的治疗。研究表明,京大戟生品峻下逐水作用强,但其水煎液可导致大鼠肝功能损伤,而经醋制后毒性显著降低,但目前尚未见对醋制降低京大戟肝毒性作用机制的明确报道。因此,京大戟肝毒性成分和醋制降低京大戟肝毒性作用机制研究对临床合理应用京大戟和醋京大戟具有重要意义。本课题研究内容主要分为以下几个部分:1.文献研究通过查阅古今相关文献、整理国内外文献,从生药学、化学成分、药理作用、炮制沿革、临床应用、毒性及配伍研究方面对京大戟的研究进展进行归纳总结,并对目前研究的现状、存在问题及研究方向等进行讨论,以期为后续研究方案的制定和实施提供参考。2.京大戟醋制前后肝细胞毒性部位的筛选采用MTT法结合细胞形态学观察,比较了京大戟醋制前后各部位对人正常肝细胞LO2细胞增殖的抑制作用。结果显示,醋制前后醇提部位对LO2细胞增殖的抑制作用强于醇提后水提部位,其中,醇提后的石油醚和乙酸乙酯部位作用最强,且生品石油醚部位对细胞增殖的抑制作用强于醋品,两者具有显著性差异(P0.05)。推测京大戟的肝细胞毒性部位可能为石油醚、乙酸乙酯混合部位。3.醋制降低京大戟对人正常肝细胞LO2的毒性及机制研究采用MTT法、Hoechst 33258荧光染色法、流式细胞术等方法比较了醋制前后京大戟对人正常肝细胞LO2的毒性作用,并探讨了其可能的作用机制。结果显示,与阴性对照组比较,京大戟生品各浓度组均可抑制LO2细胞增殖,诱导细胞凋亡,引起细胞S期阻滞,有显著性差异(P0.05);能显著升高细胞培养液上清ALT、AST、LDH活力(P0.05),显著降低细胞裂解上清SOD活性和GSH含量、增加MDA含量。醋制后,与京大戟生品组比较,可显著降低细胞凋亡率、降低细胞周期阻滞,显著降低细胞培养液上清ALT、AST、LDH活力(P0.05),显著升高细胞裂解上清SOD活性和GSH含量、显著降低MDA含量。醋制可降低京大戟对LO2细胞的毒性,其机制可能是减轻氧化损伤,从而降低细胞周期阻滞,减少细胞凋亡。4.醋制降低京大戟肝细胞毒性部位对小鼠肝毒性及机制研究为验证前期体外细胞实验结果,确定京大戟的肝毒性部位,通过给予ICR小鼠京大戟生品、醋品肝细胞毒性部位浸膏,比较了醋制前后京大戟的肝细胞毒性部位对ICR小鼠的肝毒性,并探讨了其可能的作用机制。结果显示,与阴性对照组比较,给予京大戟生品后,小鼠血清中ALT、AST、LDH活力随剂量的增加而升高,差异有统计学意义(P0.05);小鼠肝脏脏器系数增加;肝脏中MDA含量显著增高(P0.05),SOD活性和GSH含量随剂量的增加而降低,差异有统计学意义(P0.05)。醋制后,与京大戟生品组比较,可显著降低小鼠血清中ALT、AST、LDH活力(P0.05);显著降低小鼠肝脏脏器系数、减轻肝脏水肿及坏死;显著降低肝脏MDA含量,升高SOD活性和GSH含量(P0.05)。以上实验结果表明,京大戟生品的肝细胞毒性部位致小鼠肝毒性明显,氧化损伤可能是京大戟致肝毒性的机制之一,醋制可降低京大戟对小鼠的肝毒性,其机制可能是减轻氧化损伤。5.京大戟肝毒性部位化学成分研究利用硅胶柱色谱、制备薄层等手段对京大戟的肝毒性部位进行了分离纯化,通过波谱数据分析和理化性质鉴定化合物结构,采用MTT法筛选了京大戟的肝细胞毒性成分。从京大戟的肝毒性部位分离出13个化合物,鉴定了 11个化合物,分别为(1)二十四烷醇、(2)正十八烷醇、(3)十四烷酸、(4)大戟醇、(5)阿魏酸二十八酯、(6)β-谷甾醇、(7)(3β,12α,13α)-3,12-dihydroxypimara-7,15-dien-2-one、(8)pekinenal、(9)neomotiol、(10)3,3’-二甲氧基鞣花酸、(11)isopekinenal。其中,化合物1、3、7、9、11为首次从该植物中发现。化合物7、8、11对人正常肝细胞L02细胞增殖具有抑制作用,IC50分别为51.20μg-mL-1、15.72μ·gmL-1、25.49μg-mL-1。6.京大戟中二萜类成分pekinenal对人正常肝细胞的毒性研究采用MTT法、Hoechst 33258荧光染色法、流式细胞术等方法观察了 pekinenal对人正常肝细胞L02的毒性作用,并探讨其可能的作用机制。结果显示,pekinenal可抑制L02细胞增殖,改变L02细胞形态,诱导细胞凋亡,引起细胞G2/M期阻滞,差异有显著性意义(P0.05);能显著升高细胞培养液上清ALT、AST、LDH活力(P0.05),显著降低细胞裂解上清SOD活性和