小鼠胎肝间充质细胞和Sca-1～+细胞体内外向肌样细胞分化的实验研究

作     者：姜铧 

作者单位：暨南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张洹

授予年度：2005年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：胎肝 Sca-1+细胞 间充质细胞 骨骼肌细胞 心肌细胞 骨骼肌损伤 分化 

摘      要：目的:探讨小鼠胎肝间充质和Sca-1细胞在体内外向肌样细胞分化的潜能。 方法:体外无菌条件下获取胎龄14.5d的小鼠胎肝,制成单细胞悬液,贴壁培养并传代,第三代传代细胞用10μmol/15-氮胞苷与1mg/1二性霉素B诱导24h,诱导处理后置于完全培养基中继续培养,不同时间点用半定量RT-PCR法检测骨骼肌细胞相关基因Myf5,Myogenin的mRNA表达情况,培养后7d和14d,用免疫细胞化学鉴定骨骼肌细胞特异性抗原Desmin、α-Actin的表达情况。体内实验按8μg/g体重将Cardiotoxin局部注射入左侧股四头肌,造成雌鼠骨骼肌损伤模型,24h后将纯化的雄性胎肝间充质细胞按1×10/只小鼠注射至股四头肌,无菌环境下饲养2月后,处死小鼠,制备受体小鼠骨骼肌组织切片,用免疫组织化学染色对骨骼肌细胞进行特异性标记,再进一步用荧光标记的Y染色体探针进行荧光原位杂交(FISH)检测雌性受体小鼠骨骼肌组织内供体小鼠胎肝间充质细胞向骨骼肌细胞分化情况。 性别鉴定为雄性的胎肝单细胞悬液经MASC分离得到Sca-1细胞,2×10个Sca-1细胞经尾静脉移植进10Gy照射的同系雌鼠体内,2月后处死小鼠,制备受体小鼠骨骼肌、心肌组织切片,用免疫组织化学染色分别对骨骼肌细胞、心肌进行特异性标记,再进一步用荧光标记的Y染色体探针进行荧光原位杂交(FISH),检测雌性受体小鼠骨骼肌组织、心肌组织内供体小鼠胎肝Sca-1细胞分别向骨骼肌和心肌细胞的分化情况。 结果:第三代胎肝间充质细胞经5-氮胞苷与二性霉素B诱导处理后,细胞形态改变出现骨骼肌样细胞。半定量RT-PCR结果显示诱导分化后的骨骼肌细胞相关基因Myf5,Myogenin的mRNA随时间序贯表达。免疫细胞化学显示诱导分化后的细胞有骨骼肌特异性蛋白如Desmin、α-Actin的表达,且随培养时间的延长阳性率升高,未诱导组的细胞形态未发生明显变化,骨骼肌特异性蛋白表达阴性。胎肝间充质细胞体内局部注射后2月,在骨骼肌组织内发现存在Y染色体阳性的供体来源的细胞,同时免疫组织化学鉴定呈现骨骼肌组织的部分特征。胎肝Sca-1细胞体内移植后2月,在骨骼肌、心