基于氨基酸辅色作用的黑莓花青素稳定性研究及其作用机理初步探究

作     者：张钰娟 

作者单位：贵州师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周欣

授予年度：2017年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 083203[工学-农产品加工及贮藏工程] 

主      题：黑莓 矢车菊-3-O-葡萄糖苷 氨基酸 稳定性 抗氧化活性 作用机制 

摘      要：黑莓(Rubus fruticosus L.)属于蔷薇科悬钩子属植物,因富含大量天然活性物质,特别是黑莓花青素,从而受到全球消费者的青睐。目前的研究表明花青素稳定性易受到光照、p H和高温等的影响,花青素自身化学稳定性差、易降解等缺陷给工业化提取、加工、存储和相关产品开发带来了巨大障碍。虽然研究者针对这些影响因素已经提出了许多科学性的改善措施,如分子修饰、微胶囊化、金属络合等,但仍然不能满足工业生产和加工的需求。因此,本论文以保留花青素良好的生理活性为前提,在前期研究工作基础上,开展天然氨基酸与黑莓花青素通过辅色作用而提升花青素的化学稳定性研究,预期为黑莓花青素的稳定性研究提供一种可行的新方法、新思路,为黑莓花青素能更加有效地工业化和商业化应用提供科学依据。本文主要从四个方面开展研究:首先,以黑莓花青素提取物为研究对象,通过对氨基酸辅色效果的筛选,发现L-脯氨酸效果最佳,并确认L-脯氨酸具有能提高黑莓花青素体外抗氧化活性的趋势。其次,以黑莓花青素的主要活性成分之一矢车菊-3-O-葡萄糖苷为研究对象,通过半衰期(t1/2)和体外抗氧化活性实验,在分子水平上确认L-脯氨酸对矢车菊-3-O-葡萄糖苷辅色效果显著。再次,在体外活性的基础上,采用小鼠CCl4急性化学肝损伤模型,验证了L-脯氨酸在动物体内的辅色作用,高剂量下能够提高矢车菊-3-O-葡萄糖苷的保肝效果。最后,基于体内外的活性,为了更好地解释L-脯氨酸的辅色作用,采用FT-IR等方法对L-脯氨酸与矢车菊-3-O-葡萄糖苷分子间相互作用机理做初步探讨,并提出原子水平的相互作用模式。取得的主要研究成果如下:(1)氨基酸对黑莓花青素提取液稳定性及体外抗氧化活性研究以黑莓花青素提取物为研究对象,采用黑莓花青素含量变化率为评价标准,从五种氨基酸中最终筛选出L-脯氨酸为最佳辅色剂。在90℃加热6h条件下,以三种体外抗氧化模型(DPPH·、ABTS·+和羟基自由基清除实验)为测定方法检测L-脯氨酸辅色作用对黑莓花青素提取物的体外抗氧化能力的影响。结果表明:氨基酸能对黑莓花青素提取物起到稳定作用,90℃加热6h后,黑莓花青素提取物含量降低52.0%,而添加氨基酸的黑莓花青素提取物含量降低较少,其中添加L-脯氨酸的黑莓花青素提取物含量只降低34.2%。并且三种体外抗氧化模型结果显示,添加L-脯氨酸的黑莓花青素提取物的抗氧化能力比没有添加L-脯氨酸的活性更高,其中DPPH·自由基清除实验最高可提高14.7%,ABTS·+自由基清除实验最高可提高20.3%,羟基自由基清除实验最高可提高27.5%。(2)氨基酸对矢车菊-3-O-葡萄糖苷稳定性及体外抗氧化活性研究以黑莓花青素主要单体成分矢车菊-3-O-葡萄糖苷为研究对象,采用半衰期(t1/2)为评价标准进一步验证五种氨基酸对矢车菊-3-O-葡萄糖苷的辅色效果,最终筛选出L-脯氨酸为最佳辅色剂。在90℃加热6h和室温放置20 d条件下,以两种体外抗氧化模型(DPPH·和ABTS·+自由基清除实验)为测定方法检测L-脯氨酸辅色作用对矢车菊-3-O-葡萄糖苷的体外抗氧化能力的影响。结果表明:L-脯氨酸显著(p0.05)延长矢车菊-3-O-葡萄糖苷的半衰期,90℃加热6h后,t1/2从350.1min提高至474.8 min;室温放置20 d,t1/2从23814.4min提高至28875.0min。并且两种体外抗氧化模型结果显示,L-脯氨酸能显著(p0.05)提高矢车菊-3-O-葡萄糖苷的体外抗氧化活性,添加L-脯氨酸的矢车菊-3-O-葡萄糖苷的DPPH·自由基清除实验最高可提高38.5%,ABTS·+自由基清除实验最高可提高26.8%。(3)“L-脯氨酸矢车菊-3-O-葡萄糖苷复合物对CCl4急性化学肝损伤模型的影响研究以“L-脯氨酸矢车菊-3-O-葡萄糖苷复合物为研究对象,采用小鼠CCl4急性化学肝损伤中SOD,MDA,GSH-px含量变化为检测方法,评价L-脯氨酸辅色作用对矢车菊-3-O-葡萄糖苷防治肝损伤效果的提高,结果表明:高剂量的L-脯氨酸能够提高矢车菊-3-O-葡萄糖苷对CCl4诱导的小鼠急性化学肝损伤的防治效果(p0.05)。(4)L-脯氨酸与矢车菊-3-O-葡萄糖苷辅色作用机理研究。以“L-脯氨酸矢车菊-3-O-葡萄糖苷复合物为研究对象,采用UV、FT-IR、体外抗氧化活性试验为检测方法初步探讨L-脯氨酸与矢车菊-3-O-葡萄糖苷辅色作用的机理。同时以环戊酸为L-脯氨酸的阴性对照,分别对比“L-脯氨酸矢车菊-3-O-葡萄糖苷复合物、“环戊酸矢车菊-3-O-葡萄糖苷混合物的FT-IR和UV图谱的变化、体外抗氧化活性的变化。结果表明:“L-脯氨酸矢车菊-3-O-葡萄糖苷复合物在矢车菊-3-O-葡萄糖苷自身的特征峰紫外吸收强度