TAK1信号通路在创伤性脑损伤中的作用机制研究

作     者：张顶顶 

作者单位：南京大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杭春华

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：TBI TAK1 p-TAK1 5Z-7-oxozeaenol NF-κB AP-1 IL-1β TNF-α 

摘      要：第一部分 题目：创伤性脑损伤后TAKl的表达时相和定位 目的：研究TAK1在TBI后动态表达和分布情况,探讨TAK1通路和TBI的相互关系,以期为TBI的治疗提供一新的治疗靶点。 方法：1、实验模型建立和分组：选择健康成年SD雄性大鼠60只,体重为250-300g,采用改良的Feeney法于右侧开颅制作TBI模型。将动物按损伤不同时间点分为6组,分别为假手术组、伤后1h组、伤后3h组、伤后6h组、伤后12h组、伤后24h组,各组动物均为10只。 2、TBI后TAK1及p-TAK1蛋白表达测定：按不同时间点分别提取大鼠挫伤灶周围皮层脑组织,采用western blot方法检测TAK1和p-TAK1蛋白的动态表达。 3、采用免疫组化法观察：TAK1在伤灶周围脑组织的表达和分布情况。 4、采用免疫荧光技术观察：TAK1在TBI后损伤灶周围皮层中不同细胞表达和分布情况。 结果：1、TBI组术后各时间点TAK1和p-TAK1的蛋白水平24h内持续升高,24h明显升高(p0.05);2、免疫组化结果显示：假手术组中,TAK1在正常脑组织中有表达,主要分布于核周,外伤后胞浆表达量明显升高;荧光显微镜结果显示,在正常脑组织中,TAK1的表达主要位于神经元中,在星形胶质细胞中微量表达,损伤后TAK1在伤灶周围皮层的神经元和胶质细胞的胞浆中的表达量明显升高。 结论：1、TAK1在TBI早期即可被激活。 2、TBI后TAK1表达主要位于神经元和胶质细胞胞浆中,且其激活的区域与脑外伤后损伤区域相一致。 第二部分 题目：OZ对TBI的神经保护作用及机制研究 目的：通过研究OZ对TBI后TAK1通路的调控,探讨OZ对TBI的神经保护作用及其具体分子调控机制,以期为临床治疗TBI提供新的策略,同时也为OZ临床应用提供理论基础和实验依据 方法：1、实验动物模型和分组：采用健康SD大鼠,运用改良的Feeney法于右侧开颅制作TBI模型。实验动物分组：大鼠分为五组：假手术组、外伤组、外伤+溶剂组、外伤+药物组(2μg,10μg和20μg)。溶剂和药物在损伤后10mim或3h通过侧脑室注射5μ1剂量。 2、神经功能评分：采用平衡木实验评价实验动物TBI后7天内神经功能缺损状况。 3、神经元凋亡检测：取各组实验动物大脑组织,石蜡固定,切片,TUNEL法检测神经元凋亡情况。 4、炎性因子检测：取各组伤灶周围脑组织,采用ELISA法检测炎性因子的表达量;5、TAK1活性及通路下游NF-κB和AP-1的活性：取各组实验动物伤灶周围皮层组织,采用western blot方法检测TAK1和p-TAK1的蛋白含量,EMSA方法检测NF-κB和AP。1的活性。 6、尼氏染色法检测：外伤后7天神经元的存活情况。 结果：1、与假手术组相比,TBI后大鼠表现出明显的神经功能缺损、神经元凋亡,两组间有显著性差异(P0.05);而OZ治疗能明显改善大鼠神经功能评分、减轻神经元的凋亡,两组间有显著性差异(P0.05)。 2、TBI后损伤灶周围脑组织中TAK1蛋白表达增强;0Z明显下调TAK1蛋白表达。 3、与TBI组相比,OZ明显降低了NF-kB和AP-1的活性。 4、假手术组大鼠脑组织中TNF-α和IL-1p蛋白水平较低;脑损伤组中TNF-α和几.1p蛋白水平明显上调,与TBI组相比,TNF-α和IL.1p蛋白水平明显下降。 5、与假手术组相比,TBI后7天尼氏染色损伤神经元个数明显增加,而OZ治疗能明显改善神经元的损伤。 结论：1、OZ能减轻TBI后继发性损伤,对TBI有神经保护作用。 2、OZ神经保护作用是通过抑制NF-κB和AP.1通路,抑制炎性因子的产生从而减轻炎性损伤来实现。 3、以TAK1为靶点的药物治疗对临床TBI的防治具有良好的应用前景。 第三部分 题目：TAKl在TBI患者挫伤区皮层的表达和定位 目的：研究TAK1在TBI患者挫伤区皮层的表达及分布。 方法挫伤区皮层标本来自5例TBI患者,伤后取标本时间24h,阴性对照组为3例肿瘤患者的正常脑组织(由于手术入路要求切除的),通过免疫组织化学和免疫荧光方法检测TAK1在挫伤皮层的表达和定位。 结果：与阴性对照组相比,免疫组化结果显示挫伤区皮层TAK1的表达量明显升高;免疫荧光结果显示TAK1在TBI患者挫伤区皮层的神经元和胶质细胞中均有表达。 结论：TAK1在挫伤区皮层的表达量升高,提示针对TAK1的靶点治疗在TBI的临床治疗中具有重要的临床应用价值。